在 LC-MS/MS、GC-MS、HPLC、ICP-MS、UV、荧光检测和代谢组学实验中，定量分析的核心问题是：如何把仪器信号转换为样品中目标物的真实浓度。常见定量方法主要包括 外标法、内标法和标准加入法。

三种方法都可以用于定量，但适用场景不同。外标法操作简单，适合基质较简单、仪器响应稳定的样品；内标法通过加入固定量内标，可以校正前处理损失、进样误差和仪器响应波动；标准加入法则更适合复杂基质或没有空白基质的样品，尤其适用于基质效应明显、目标物本身为内源性成分的实验。FDA/ICH M10 对生物分析方法中的校准曲线定义为：标称分析物浓度与分析平台响应之间的关系，并强调校准标准通常应在与研究样品相同的生物基质中制备。

一、为什么定量实验需要校准方法？

仪器检测得到的通常不是“浓度”，而是信号，例如峰面积、峰高、吸光度、荧光强度或离子响应。要得到浓度，就需要建立信号与浓度之间的关系。

常见问题包括：

因此，选择合适的定量方法，本质上是在解决两个问题：

第一，标准品和真实样品的响应是否可比；
第二，实验过程中的误差能否被有效校正。

二、外标法：最基础、最常见的定量方法

1. 什么是外标法？

外标法也叫外部校准法，是用一组已知浓度的标准溶液建立标准曲线，然后根据未知样品的仪器响应，代入标准曲线计算浓度。FDA 和 ICH M10 文件中所说的 calibration curve，本质上就是分析物浓度与仪器响应之间的关系。

外标法的基本关系可以理解为：

A=kC+bA=kC+bA=kC+b

其中：

建立标准曲线后，将未知样品的响应值 A 代入曲线，即可反算样品浓度。

2. 外标法的一般流程

3. 外标法的优点

外标法最大的优点是简单、快速、成本低。它不需要额外加入内标，也不需要对每个样品进行加标处理，适合方法开发初期、常规质控和基质较简单的样品。

适用场景包括：

4. 外标法的局限性

外标法默认“标准溶液”和“真实样品”在仪器中的响应行为一致。但在复杂样本中，这个假设经常不成立。

例如，在血浆、尿液、组织、食品、环境样本中，基质组分可能影响目标物离子化，使同样浓度的目标物在标准溶液和真实样品中产生不同信号。LibreTexts 的分析化学教材也指出，基质效应会导致样品中分析物信号受到样品中其他成分影响，此时标准加入法常用于校正这类问题。

外标法主要不足包括：

三、内标法：复杂样本定量中更常用的方法

1. 什么是内标法？

内标法是在标准品、质控样品和未知样品中都加入固定量的内标物。检测时不直接使用目标物峰面积，而是使用：

目标物响应 / 内标响应

来建立标准曲线或计算浓度。Shimadzu 对内标法的说明中也指出，内标法是基于目标组分和内标之间的峰面积比与浓度比关系进行定量。

内标法的基本关系可以表示为：

AxAIS=kCxCIS+b\frac{A_x}{A_{IS}}=k\frac{C_x}{C_{IS}}+bAIS​Ax​​=kCIS​Cx​​+b

其中：

2. 内标法为什么更适合 LC-MS/MS？

LC-MS/MS 检测中常见基质效应、离子抑制、离子增强和仪器响应漂移。内标法通过在每个样品中加入固定量内标，使目标物和内标共同经历样本处理、色谱分离和质谱检测。稳定同位素内标尤其适合复杂基质，因为它与目标物结构高度相似，通常能更好地补偿基质效应和分析过程波动。Waters 的技术资料强调，稳定同位素内标用于补偿基质效应时，内标与目标物的共洗脱表现非常关键。

3. 内标法的一般流程

4. 内标法的优点

5. 内标法的关键点

内标法是否可靠，取决于内标选得是否合适。

理想内标应满足：

6. 内标法的局限性

内标法虽然常用，但并不是万能的。

四、标准加入法：复杂基质和无空白基质时的重要方法

1. 什么是标准加入法？

标准加入法也叫加标法，是将已知量的目标物标准品直接加入到未知样品中，通过样品本身加标前后响应的变化来反推原样品中目标物浓度。它的核心思想是：让标准品和未知样品处在完全相同或高度相似的基质环境中。

LibreTexts 对标准加入法的解释是：它与外标法一样通过已知标准与样品响应比较进行定量，但标准品是加入到样品本身中，用于校正基质效应。

标准加入法的结果常通过外推得到：

Cx=−xinterceptC_x=-x_{\mathrm{intercept}}Cx​=−xintercept​

简单理解：把不同加标量下的响应值做线性回归，曲线在 x 轴上的截距绝对值，就是原样品中目标物的浓度。

2. 标准加入法的一般流程

3. 标准加入法适合什么情况？

标准加入法特别适合以下场景：

标准加入法不需要真正的空白基质，这一点对内源性代谢物很重要。例如血浆中本身含有氨基酸、胆汁酸、乳酸、葡萄糖等成分，如果找不到完全空白基质，标准加入法可以作为一种替代思路。Chromatography Online 对内源性小分子定量策略的讨论中也提到，标准加入法通过每个样品自身建立校准关系，可以考虑个体间基质效应差异。

4. 标准加入法的优点

5. 标准加入法的局限性

因此，标准加入法更适合作为复杂样本中的确认方法、方法开发工具，或在没有合适空白基质和内标时使用。

五、三种方法的核心区别

六、怎么选择：外标法、内标法还是标准加入法？

1. 样本简单，基质干扰少：优先外标法

如果样本是纯溶液、标准品溶液、简单制剂或前处理非常简单，外标法通常已经可以满足需求。

适合：

• 标准品纯度测定；
• 简单制剂含量测定；
• 水溶液中目标物检测；
• 初步方法开发；
• 仪器响应稳定的小批量实验。

2. 样本复杂，且有合适内标：优先内标法

如果样本是血浆、尿液、组织、细胞、食品、环境样本，且目标物有合适的稳定同位素内标，优先推荐内标法。

适合：

• LC-MS/MS 靶向定量；
• 药物浓度检测；
• 代谢组学；
• 脂质组学；
• 临床样本检测；
• 胆汁酸、氨基酸、激素、维生素定量；
• 多批次大样本分析。

3. 基质效应强，或没有空白基质：考虑标准加入法

如果目标物是内源性物质，难以获得空白基质，或者样品基质差异非常大，标准加入法更有参考价值。

适合：

• 内源性代谢物定量；
• 难以制备基质匹配标准曲线的样品；
• 食品、环境、土壤、中药、复杂提取物；
• 单个样品或少量样品的准确定量；
• 方法学确认或疑难样本验证。

七、三种方法在代谢组学实验中的应用

1. 非靶向代谢组学

非靶向代谢组学更关注代谢物筛查和相对差异分析，通常会使用 QC 样本、批次校正和少量代表性内标。但如果要对某些差异代谢物进行后续准确定量，就需要转入靶向方法，通常使用内标法或基质匹配标准曲线。

2. 靶向代谢组学

靶向代谢组学更强调绝对定量和批间可比性，因此更推荐使用内标法。对于复杂生物样本，稳定同位素内标可以明显提高结果可靠性。生物分析方法验证指南中也强调校准曲线、质控样本和基质匹配的重要性，这与靶向定量实验的实际需求一致。

3. 内源性代谢物定量

内源性代谢物本身存在于血浆、尿液和组织中，常常找不到真正空白基质。此时可考虑：

八、实际实验中常见误区

误区一：外标法一定不准

外标法不是不准，而是适用条件有限。对于基质简单、仪器稳定、前处理误差小的样品，外标法完全可以使用。问题在于复杂生物样本中，外标法往往难以校正基质效应和回收率差异。

误区二：用了内标就一定准确

内标法的前提是内标选得合适。如果内标与目标物保留时间差异大、离子化行为不同、提取回收率不同，校正效果会明显下降。稳定同位素内标通常比普通结构类似物更理想，但仍需要进行方法验证。

误区三：标准加入法最准确，所以所有实验都应该用

标准加入法在复杂基质中很有价值，但它操作繁琐、通量低、标准品消耗大，不适合大批量样本常规检测。对于上百个样本的靶向代谢组学项目，通常更实际的方案是内标法结合基质匹配校准和 QC 校正。

误区四：标准曲线只要线性好就可以

线性好只是方法可靠的一个方面，还要看准确度、精密度、回收率、基质效应、稳定性和定量下限。尤其在 LC-MS/MS 中，标准溶液中的线性好，不代表真实样品中的定量一定准确。

误区五：内标可以最后再加

如果内标在样本提取后才加入，只能校正进样和仪器响应，不能校正前处理损失。对于血浆蛋白沉淀、组织匀浆、固相萃取、液液萃取等流程，内标通常应尽量早加入。

九、方法选择建议

可以按下面这个逻辑判断：

十、技术支持总结

外标法、内标法和标准加入法都是常见的定量分析方法。外标法简单高效，适合基质简单、响应稳定的样品；内标法通过加入固定量内标，能够校正进样误差、仪器波动和部分前处理损失，是 LC-MS/MS、GC-MS、靶向代谢组学和药物分析中最常用的方法之一；标准加入法通过将标准品直接加入未知样品，可以有效降低基质差异带来的影响，适合复杂基质、无空白基质和内源性目标物定量。

在实际实验中，方法选择不应只看哪种“更高级”，而应根据样本基质、目标物性质、检测平台、是否有合适内标、是否能获得空白基质、样本量大小和定量准确度要求综合判断。对于血浆、尿液、组织等复杂样本，优先考虑稳定同位素内标法；对于基质效应极强或空白基质难以获得的样品，可结合标准加入法进行验证或确认。