2026-08-17 15:28:32
肝素的抗凝活性、硫酸乙酰肝素的细胞信号调节作用，以及硫酸软骨素在软骨、细胞外基质、神经系统和肿瘤微环境中的生物学功能，都与其二糖组成和硫酸化模式密切相关。肝素通常具有较高硫酸化程度，而硫酸乙酰肝素的低硫酸化和高硫酸化结构域分布更加复杂。硫酸软骨素则可以根据GalNAc的4-O、6-O以及糖醛酸2-O位点硫酸化形成C4S、C6S、CS-D、CS-E等不同结构。
因此，在肝素质量评价、低分子肝素研究、硫酸乙酰肝素结构研究、软骨和骨代谢、骨关节炎、肿瘤、神经系统疾病、糖胺聚糖代谢以及生物药质量控制中，经常需要对完整GAG多糖进行酶解，再通过LC-MS或LC-MS/MS测定其二糖组成。
典型实验技术路线可以概括为：
样本提取-GAG富集和纯化-蛋白及杂质去除-肝素酶或软骨素酶完全酶解-获得不饱和二糖-AMAC或其他方式衍生化-去除过量试剂-LC分离-MS/MS检测-标准曲线定量-计算不同二糖相对丰度和硫酸化程度
本文围绕“肝素和硫酸软骨素二糖组成分析方法”，系统介绍肝素/硫酸乙酰肝素和硫酸软骨素/皮肤素硫酸的结构特点、酶解原理、二糖标准品、AMAC衍生化、LC-MS/MS分析、稳定同位素内标、定量计算、方法学验证以及实验中常见问题。
糖胺聚糖并不是由完全相同的重复二糖组成。
例如肝素和硫酸乙酰肝素的基本重复单元由糖醛酸和葡萄糖胺组成，但糖醛酸可以是GlcA或者IdoA，葡萄糖胺可以是GlcNAc、GlcNS或者非取代GlcN，同时还可能发生2-O和6-O硫酸化。
硫酸软骨素和皮肤素硫酸则主要由糖醛酸和GalNAc组成，常见修饰包括GalNAc 4-O-sulfation、GalNAc 6-O-sulfation和UA 2-O-sulfation。
所谓“二糖组成分析”，就是首先使用特异性多糖裂解酶将完整GAG链尽可能完全降解为二糖，然后利用HPLC、UPLC、LC-MS或LC-MS/MS分别测定各种硫酸化二糖的含量。
最终可以得到类似下面的信息：
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分析对象 |
可以获得的信息 |
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肝素/HS |
0S、NS、6S、2S、NS6S、NS2S、2S6S、TriS比例 |
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硫酸软骨素 |
0S、4S、6S、2S、4S6S、2S4S、2S6S、TriS比例 |
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整体GAG |
总二糖含量 |
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硫酸化模式 |
单硫酸、双硫酸、三硫酸结构比例 |
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位点修饰 |
N-S、2-O-S、4-O-S、6-O-S比例 |
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样本比较 |
不同组织、疾病、药物处理或批次之间的结构变化 |
因此，二糖组成分析并不是简单测量“肝素总量”或者“硫酸软骨素总量”，而是进一步解析这些多糖内部的精细硫酸化组成。
Heparin和Heparan sulfate的基本骨架类似，均由糖醛酸和葡萄糖胺重复连接形成。
其结构差异主要体现在硫酸化程度、N-乙酰化程度以及IdoA含量。
通常情况下，肝素具有更高的N-硫酸化和O-硫酸化水平，而HS中低硫酸化结构域比例更高。肝素中的高度硫酸化结构通常使TriS等二糖占比较高，而HS中0S和低硫酸二糖通常更加丰富。
Chondroitin sulfate主要由GlcA和GalNAc构成。
根据硫酸化位置不同，可以形成不同类型。
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类型 |
典型结构特征 |
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CS-A |
GalNAc 4-O-sulfation为主 |
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CS-C |
GalNAc 6-O-sulfation为主 |
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CS-D |
UA 2-O-sulfation + GalNAc 6-O-sulfation |
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CS-E |
GalNAc 4-O + 6-O双硫酸化 |
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CS-B |
通常指Dermatan sulfate |
CS-A和CS-C主要区别在GalNAc硫酸化位置，而Dermatan sulfate的重要特点是含有较多IdoA。
Dermatan sulfate，简称DS，过去也常被称为Chondroitin sulfate B。
CS与DS的重要区别之一在于糖醛酸。
CS中主要为GlcA，而DS中存在大量IdoA。
但这一信息在普通完全酶解二糖分析中可能部分丢失，因此如果研究目的包括区分CS和DS，需要进一步设计选择性酶解实验。
肝素酶和软骨素裂解酶通常不是简单进行水解，而是通过β-elimination方式切断糖苷键。
酶切以后，糖醛酸非还原端会形成4,5-unsaturated uronic acid，通常表示为：
ΔUA
因此肝素、HS、CS和DS经裂解酶处理以后产生的是一系列ΔUA-containing unsaturated disaccharides。
这种双键结构还能够产生约232 nm紫外吸收，因此传统HPLC-UV方法也可以利用这一特点进行检测。
需要特别理解：
原多糖中的GlcA和IdoA在裂解以后都可能转化成ΔUA。
因此：
完整多糖中的GlcA/IdoA差向异构信息-完全裂解形成ΔUA-普通二糖组成分析不能完整恢复原始GlcA/IdoA位置
这也是二糖组成分析的重要局限之一。
对于组织、细胞、血浆、尿液、软骨、肝素原料或重组GAG样品，一个比较完整的分析流程可以设计为：
样本收集-组织匀浆或溶液处理-蛋白酶消化释放GAG-GAG富集和纯化-脱盐和浓缩-根据研究对象分别加入Heparinase I/II/III或Chondroitinase系列酶-充分酶解生成不饱和二糖-离心或超滤去除酶和大分子-冻干或浓缩-AMAC衍生化-还原胺化-样本稀释或净化-LC-MS/MS分析-标准曲线定量-稳定同位素内标校正-计算各二糖比例和总GAG水平
对于纯肝素钠、低分子肝素或者高纯度CS标准品，可以减少前面的组织蛋白消化和GAG富集步骤。
对于组织、细胞和血浆等复杂样本，则样本前处理往往比LC-MS本身更加关键。
大多数组织中的GAG并不是游离存在。
HS和CS经常连接在proteoglycan core protein上。
如果直接加入裂解酶，蛋白质、脂质和其他生物大分子可能影响酶解效率和后续质谱检测。
因此组织和细胞GAG分析通常需要先释放和纯化GAG。
常见思路为：
组织或细胞-蛋白酶消化-去除蛋白和肽段-GAG富集-脱盐-酶解二糖
已有血清GAG分析和组织GAG分析方法均使用蛋白消化及GAG纯化后再进行酶解和LC-MS检测。
肝素和HS结构高度异质，如果只使用一种肝素裂解酶，很容易出现酶解不完全。
Heparinase I、II和III具有不同底物偏好。
Heparinase I对肝素和HS高度硫酸化结构域活性较强。
Heparinase II底物特异性较宽，可以作用于肝素和HS多种结构。
Heparinase III更加偏向低硫酸化HS结构。
因此，为获得尽可能完整的二糖组成，常见做法是组合使用Heparinase I、II和III。
典型流程为：
肝素/HS样本-Heparinase I + Heparinase II + Heparinase III充分酶解-生成ΔUA-containing unsaturated disaccharides-去除酶-LC-MS分析
这种酶组合可以减少不同结构域裂解效率差异造成的组成偏差。
Heparinase II通常具有比较宽的底物特异性，可以同时作用于高度硫酸化和低硫酸化区域。
因此它在I、II、III联合酶解体系中起到非常重要的补充作用。
但仅使用Heparinase II仍然不能保证所有复杂肝素/HS样品达到理想完全降解。
因此，如果实验目的是精确二糖组成分析，一般仍建议采用I+II+III组合，并通过增加酶量或延长反应时间进行完全酶解验证。
硫酸软骨素和Dermatan sulfate分析最常使用的酶之一是Chondroitinase ABC。
Chondroitinase ABC可以裂解chondroitin 4-sulfate、chondroitin 6-sulfate和dermatan sulfate，并生成含不饱和糖醛酸的降解产物。
因此，如果实验目的只是测量：
CS + DS整体二糖组成
Chondroitinase ABC通常非常实用。
实验流程可以设计为：
CS/DS样本-Chondroitinase ABC充分酶解-获得8类主要不饱和二糖-AMAC标记-LC-MS/MS定量
不能简单依靠Chondroitinase ABC完全区分。
因为Chondroitinase ABC既能够裂解chondroitin sulfate，也能够裂解dermatan sulfate。
当原始多糖中的GlcA或IdoA经裂解形成ΔUA以后，部分原始糖醛酸立体化学信息会丢失。
因此，如果研究重点是：
CS和DS分别有多少
建议增加选择性酶解。
一种常见思路是同时使用Chondroitinase AC和Chondroitinase B。
Chondroitinase AC主要作用于含GlcA的chondroitin sulfate A/C，而通常不降解dermatan sulfate；Chondroitinase B则具有明显的DS选择性。
可以采用：
总CS/DS-Chondroitinase ABC测总量
同时建立：
平行样本-Chondroitinase AC测GlcA型CS
以及：
平行样本-Chondroitinase B测IdoA-rich DS
这样比单独使用ABC更加有利于区分CS和DS来源。
常规肝素和HS LC-MS组成分析中，最常测定的8种二糖如下。
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简称 |
结构 |
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0S |
ΔUA-GlcNAc |
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NS |
ΔUA-GlcNS |
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6S |
ΔUA-GlcNAc6S |
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2S |
ΔUA2S-GlcNAc |
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NS6S |
ΔUA-GlcNS6S |
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NS2S |
ΔUA2S-GlcNS |
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2S6S |
ΔUA2S-GlcNAc6S |
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TriS |
ΔUA2S-GlcNS6S |
这8种结构覆盖了N-acetylation、N-sulfation、2-O-sulfation和6-O-sulfation的主要组合，是肝素和HS二糖组成分析中最常使用的核心面板。LC-MS方法已经能够对这8种主要二糖进行分离和定量。
如果进一步考虑N-unsubstituted glucosamine，即GlcN结构，则肝素/HS二糖可以扩展到12种经典结构。
完整结构包括：
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代码 |
结构 |
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IVA |
ΔUA-GlcNAc |
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IIIA |
ΔUA2S-GlcNAc |
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IIA |
ΔUA-GlcNAc6S |
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IA |
ΔUA2S-GlcNAc6S |
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IVH |
ΔUA-GlcN |
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IIIH |
ΔUA2S-GlcN |
|
IIH |
ΔUA-GlcN6S |
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IH |
ΔUA2S-GlcN6S |
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IVS |
ΔUA-GlcNS |
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IIIS |
ΔUA2S-GlcNS |
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IIS |
ΔUA-GlcNS6S |
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IS |
ΔUA2S-GlcNS6S |
早期LC-MS/MS研究已经建立了12种已知肝素二糖的定量框架。
对于普通肝素质量分析，8种核心二糖通常已经能够覆盖主要组成。
对于糖工程、特殊HS结构、N-deacetylation/N-sulfation研究以及高精细结构研究，则可以进一步扩展到12种。
CS/DS通常包括以下8类二糖。
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简称 |
结构 |
典型含义 |
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0S |
ΔUA-GalNAc |
无硫酸 |
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4S |
ΔUA-GalNAc4S |
C4S |
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6S |
ΔUA-GalNAc6S |
C6S |
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2S |
ΔUA2S-GalNAc |
UA 2-O-sulfation |
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SB / 2S4S |
ΔUA2S-GalNAc4S |
双硫酸 |
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SD / 2S6S |
ΔUA2S-GalNAc6S |
CS-D相关 |
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SE / 4S6S |
ΔUA-GalNAc4S6S |
CS-E相关 |
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TriS |
ΔUA2S-GalNAc4S6S |
三硫酸 |
这些结构已经被广泛用于组织、细胞和疾病模型的CS/DS二糖定量。
ΔUA-GalNAc4S与ΔUA-GalNAc6S分子质量相同。
它们只是硫酸基位置不同。
因此属于典型位置异构体。
这意味着：
相同分子量不等于相同结构
如果色谱不能充分分开4S和6S，即使质谱测得准确分子量，也不能可靠区分二者。
这也是GAG二糖分析特别强调色谱分离的原因之一。
在软骨研究、发育研究以及骨关节炎等课题中，4S/6S比例本身就是非常重要的结构指标。CS二糖硫酸化模式也被用于评价组织成熟和疾病状态。
AMAC全称：
2-Aminoacridone
是一种常用糖类荧光衍生化试剂。
其结构中同时含有荧光基团和氨基，可以与还原性GAG二糖的还原端反应。
经过还原胺化以后，每个二糖连接一个AMAC标签。
AMAC衍生化具有几个重要作用：
第一，提高反相色谱保留；第二，提高荧光检测灵敏度；第三，改善部分GAG二糖的LC-MS响应；第四，有利于分离不同硫酸化二糖；第五，可在同一LC-MS平台同时分析HS、CS/DS和HA来源二糖。
已有方法使用AMAC对GAG二糖进行标记，并能够将多种HS、CS/DS和HA二糖进行良好分离。
AMAC中的氨基首先与GAG二糖还原端醛基反应形成亚胺中间体。
随后使用还原剂将其转化成稳定的二级胺连接产物。
常用还原剂为：
Sodium cyanoborohydride
即氰基硼氢化钠。
基本过程可以横向表示为：
酶解二糖-样本浓缩或冻干-加入AMAC溶液-AMAC与还原端反应-加入氰基硼氢化钠进行还原胺化-孵育完成-AMAC-GAG二糖形成-稀释或净化-LC-MS/MS
不同实验室的AMAC浓度、反应温度和时间会有所不同，因此不建议把某一个条件作为唯一标准方法。
一项常用的GAG二糖LC-MS方法中，约5 μg GAG来源二糖或标准品加入0.1 M AMAC，AMAC溶于AcOH/DMSO体系，随后加入NaBH3CN，并在45℃进行数小时反应。
因此方法开发时可以围绕几个参数优化：
AMAC浓度、AMAC/样本摩尔比、DMSO/AcOH比例、NaBH3CN浓度、反应时间、反应温度以及衍生化后稀释比例。
最终判断标准不是“标签加得越多越好”，而是：
标记反应充分-游离AMAC不严重干扰-各二糖响应稳定-峰形良好-重复性合格
不一定。
部分已发表LC-MS方法可以直接将AMAC标记后的样本稀释后进样，无需完全去除游离AMAC。
但是在复杂样本、高灵敏方法或者长期大批量检测中，过量AMAC可能造成背景升高、色谱柱污染或者离子源污染。
因此实际可以在两种方案之间选择。
第一种：
酶解-AMAC标记-适当稀释-直接LC-MS
适合方法成熟、样本较干净、通量要求高的体系。
第二种：
酶解-AMAC标记-去除游离标签或进行净化-LC-MS
适合复杂组织样本和对低丰度结构要求较高的研究。
GAG二糖并不是必须进行AMAC标记。
常见分析路线还包括：
第一，RPIP-LC-MS，即反相离子对色谱质谱。
第二，HILIC-MS/MS。
第三，PGC-LC-MS。
第四，强阴离子交换色谱。
第五，毛细管电泳。
第六，2-AA等还原胺化衍生化方法。
RPIP-UPLC-MS已经能够分离8种常见肝素/HS二糖。
HILIC-MS/MS也已经用于8种肝素/HS二糖的同步测定。
对于需要较高通量、成熟MS平台以及同时分析CS和HS的实验室，AMAC-RP-LC-MS/MS通常仍然是一套非常实用的方案。
2-AA，即2-Aminobenzoic acid，也可以与GAG还原端进行还原胺化。
更加重要的是，2-AA可以发展成轻/重同位素标签。
早期CS/DS定量研究已经使用普通d0-2-AA和重型d4-2-AA分别标记标准品和样本，再通过LC-MS/MS进行相对定量。
因此对于需要不同样本之间高精度比较的研究，可以采用：
标准品-d0标签-实验样本-d4标签-标记样本混合-LC-MS/MS-根据轻重离子峰面积比定量
这种策略和直接使用13C二糖内标属于两种不同的稳定同位素定量思路。
不同方法具有不同优势。
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色谱方式 |
优点 |
主要用途 |
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AMAC-RP-LC |
分离稳定、MS兼容性好 |
HS/CS/DS综合分析 |
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RPIP-LC |
对高度带负电二糖保留好 |
Heparin/HS |
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HILIC |
不依赖高浓度离子对试剂 |
HS/CS直接分析 |
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PGC |
异构体分离能力较强 |
结构研究 |
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SAX |
按电荷/硫酸化程度分离 |
经典GAG分析 |
如果实验室需要兼顾LC-MS离子源清洁度，通常要谨慎使用难挥发的离子对试剂。
如果主要检测AMAC衍生物，普通反相C18体系通常更加方便。
天然GAG二糖具有多个羧基和硫酸基，因此非常适合负离子模式。
AMAC标记以后，很多方法仍然采用ESI负离子模式进行检测。
例如已发表的CS/DS AMAC-LC-MS方法使用负离子电喷雾检测，并通过EIC或MS/MS完成定量。
对于高度硫酸化结构，需要特别注意：
硫酸基数量增加-分子负电荷增加-多电荷离子增加-源内脱硫酸风险增加-MS参数需要重新优化
因此0S、单硫酸、双硫酸和TriS不一定可以直接使用完全相同的碰撞能和离子源条件。
硫酸酯键相对容易发生气相碎裂。
如果离子源温度、fragmentor voltage或碰撞能过高，就可能出现SO3丢失。
这样会造成两个问题。
第一，目标二糖信号降低。
第二，可能产生与低硫酸化结构质量相近的碎片，从而增加误判风险。
因此对TriS、2S6S、NS6S以及其他高度硫酸化结构，需要单独优化MRM或PRM条件。
当目标二糖结构已经明确以后，可以使用Triple Quadrupole建立MRM方法。
典型过程为：
标准品确定母离子-优化产物离子-确定每种二糖MRM transition-优化碰撞能-建立保留时间窗口-标准曲线定量
MRM具有较高灵敏度和选择性，特别适合组织、血浆、尿液以及小体积细胞样本中的GAG二糖检测。
已有方法可以在一次LC-MS/MS分析中同步定量多类GAG二糖。
很多GAG二糖属于位置异构体。
例如：
CS 4S与CS 6S
以及：
HS NS2S与HS NS6S
可能具有相同或者非常接近的分子质量。
因此不能只根据m/z判断结构。
标准品至少承担四个作用。
第一，确认保留时间。
第二，确认母离子和碎片离子。
第三，建立标准曲线。
第四，确认位置异构体色谱分离。
所以在建立GAG二糖LC-MS方法时，最好一次性配置完整8种HS核心二糖以及8种CS/DS二糖，而不是只购买其中几个高丰度结构。
复杂生物样本分析中会出现很多误差来源，例如酶解损失、样本转移损失、衍生化效率变化、离子抑制以及仪器响应漂移。
普通外标曲线只能校正其中一部分。
如果使用与目标二糖结构相同的13C稳定同位素内标，则内标与目标物具有非常接近的色谱和质谱行为，因此能够明显提高定量可靠性。
研究人员已经建立了使用8种13C标记HS二糖和13C标记HS多糖校准物进行HS定量的方法。
对于8种核心HS二糖，可以分别使用相应13C结构。
典型组合为：
0S-13C、NS-13C、6S-13C、2S-13C、NS6S-13C、NS2S-13C、2S6S-13C、TriS-13C
理想情况下：
一个目标二糖-一个结构完全匹配的13C内标
这样可以分别校正不同硫酸化程度导致的离子化差异。
如果13C内标在酶解完成以后才加入，它只能很好地校正衍生化和LC-MS检测过程。
但无法完全校正：
GAG提取效率和酶解效率
如果使用13C标记完整HS多糖，并在酶解之前加入，则可以进一步覆盖：
样本处理-GAG回收-酶解释放-衍生化-LC-MS
整个过程。
因此，从全过程质量控制角度：
13C多糖内标比酶解后加入13C二糖更接近全过程内标
实际研究已经使用13C标记多糖校准物结合13C二糖进行定量。
有相关研究应用。
例如已经有研究使用13C标记CS二糖校准物，包括di-0S、di-4S、di-6S和di-4S6S等结构，用于提高CS组成LC-MS定量准确度。
因此对于CS重点课题，可以优先考虑：
CS-0S-13C-CS-4S-13C-CS-6S-13C-CS-4S6S-13C
如果需要覆盖2S4S、2S6S以及TriS等低丰度结构，则可进一步考虑定制同位素标准品。
最常见计算方式是摩尔百分比。
例如某一种HS二糖：
目标二糖摩尔量/全部HS二糖摩尔量总和×100%
得到该二糖占总HS的mol%。
同样可以计算CS。
例如：
CS-4S比例=4S摩尔量/全部CS二糖摩尔量×100%
这样可以得到：
0S%、4S%、6S%、2S%、SE%、SD%等。
除了逐个报告二糖，还可以进一步计算Average sulfation degree。
例如一个0S二糖含0个硫酸基，一个单硫酸二糖含1个，一个双硫酸二糖含2个，一个TriS含3个。
因此可以按照：
各二糖摩尔分数×对应硫酸基数量
进行加权。
最终得到：
平均每个二糖含多少个硫酸基
这一指标特别适合比较：
肝素和HS、不同肝素来源、不同生物工艺批次、CS-A与CS-C以及疾病组和正常组。
对于普通肝素结构分析，可以优先观察：
TriS、NS6S、NS2S、2S6S、NS、2S、6S、0S。
其中TriS，即ΔUA2S-GlcNS6S，通常是高度硫酸化肝素中的重要组成部分。
研究显示，典型肝素中TriS比例明显高于HS，而HS中0S等低硫酸结构占比通常更高。
因此：
TriS高+N-sulfation高+2-O/6-O sulfation高
通常更加符合肝素的高硫酸化特征。
二糖组成分析非常重要，但不能完整描述低分子肝素全部结构。
低分子肝素还涉及：
平均分子量、分子量分布、链端结构、工艺产生的特殊结构以及抗凝活性等。
因此LMWH质量分析更加完整的技术路线通常是：
分子量分布-二糖组成-寡糖结构-链端结构-特征工艺标志物-抗Xa/抗IIa活性
二糖分析主要反映整体硫酸化组成，而不能直接恢复多糖序列。
CS-A通常以4S结构为主要特征。
CS-C通常以6S结构为主要特征。
CS-D的重要结构之一是2S6S。
CS-E的重要结构之一是4S6S，即SE二糖。
因此可以通过：
4S-6S-2S6S-4S6S比例
判断不同CS样品硫酸化特征。
但天然CS通常并不是完全单一结构，因此不应该看到4S就简单判断样品是“纯CS-A”。
更加合理的方法是报告完整二糖组成。
软骨和细胞外基质中的CS硫酸化模式会随着组织成熟、疾病状态和细胞环境变化。
因此：
4S/6S比例
以及：
4S6S、2S6S等二硫酸结构
经常作为软骨基质和GAG重塑的研究指标。
GAG二糖硫酸化模式已经被用于软骨形成和骨关节疾病相关研究。
常见方向包括：
肝素原料质量控制、不同动物来源肝素比较、低分子肝素研究、重组肝素研究、HS糖工程、肿瘤细胞HS研究、病毒与HS结合研究、炎症、血管生成、发育生物学以及细胞外基质研究。
如果课题重点是完整HS结构功能关系，仅做二糖组成通常还不够。
可以进一步增加：
二糖组成-寡糖分析-MS/MS sequencing-3-O-sulfation结构分析-蛋白结合实验
常见方向包括：
软骨组织、骨关节炎、椎间盘、神经系统细胞外基质、肿瘤微环境、纤维化、皮肤、结缔组织、药用硫酸软骨素、保健品质量评价以及不同动物来源CS比较。
对于疾病研究，可以将GAG二糖结果进一步与：
基因表达、硫酸转移酶表达、硫酸酯酶表达、蛋白多糖水平、组织病理以及炎症指标进行联合分析。
血浆和尿液中的GAG浓度通常远低于软骨或纯GAG制品。
同时还存在盐、蛋白、小分子以及其他带电物质。
因此需要重点解决：
第一，GAG提取回收率；第二，背景离子抑制；第三，低丰度二糖检测灵敏度；第四，批间稳定性。
LC-MS/MS已经被用于血清、血浆和尿液中HS、CS、DS等GAG分析。
对于这类复杂基质，稳定同位素内标的价值尤其明显。
一个可靠的GAG二糖LC-MS方法至少应该评价以下内容。
第一，酶解完全性。
第二，衍生化效率。
第三，标准曲线线性。
第四，LLOQ和LOD。
第五，准确度。
第六，批内精密度。
第七，批间精密度。
第八，加标回收率。
第九，基质效应。
第十，样本稳定性。
第十一，衍生物自动进样器稳定性。
第十二，Carryover。
尤其需要注意：
LC-MS重复性很好并不代表整个方法重复性很好
因为整个实验还包括GAG提取、酶解、衍生化和样本转移。
真正的方法学CV最好从独立样本前处理开始计算。
可以采用酶量和时间双重验证。
例如：
1×酶量-2×酶量
同时比较：
短时间酶解-常规时间酶解-延长酶解
如果继续增加酶量和时间以后，总二糖含量以及各主要二糖比例基本稳定，则说明酶解已经接近充分。
如果TriS或者高度硫酸结构随着酶量增加仍不断升高，则说明原方法可能存在降解不完全。
不同硫酸化程度二糖的LC-MS响应因子可能不同。
因此不能简单假设：
1 ng 0S的MS响应=1 ng TriS的MS响应
更加合理的方法是每一种目标二糖分别建立标准曲线。
已发表GAG LC-MS方法也是利用不同不饱和二糖标准品建立定量曲线。
如果配置13C匹配内标，则可以采用：
目标二糖峰面积/对应13C内标峰面积
作为定量信号。
第一，不能直接获得完整多糖序列。
第二，很多GlcA和IdoA信息在裂解形成ΔUA以后无法完整保留。
第三，无法直接确定硫酸基在整条多糖链上的连续分布。
第四，不能仅凭二糖组成推断特定蛋白结合位点。
第五，稀有3-O-sulfated结构可能需要专门的寡糖或特异性分析方法。
第六，CS和DS在使用ABC完全酶解以后部分来源信息会丢失。
因此二糖组成分析最适合回答的问题是：
这条GAG总体由哪些硫酸化二糖构成，以及各种结构比例是多少？
如果实验目标是回答：
这些结构在多糖链上的排列顺序是什么？
则必须进一步进入寡糖测序和结构解析层级。
首先检查色谱柱和梯度。
4S和6S属于位置异构体，m/z相同，因此真正的定量必须首先实现色谱分离。
如果两个峰严重重叠，可以考虑优化：
柱温、有机相比例、缓冲盐浓度、梯度斜率和色谱柱类型。
还可以考虑更换HILIC或者PGC等分离模式。
可能原因主要包括：
第一，高度硫酸化结构源内脱硫酸。
第二，质谱参数过强。
第三，酶解不足。
第四，样本中TriS确实含量低。
第五，衍生化效率或者峰形不好。
第六，标准品和样本盐型差异较大。
因此建议采用：
TriS标准品单标优化离子源参数-TriS同位素内标校正-再进入混标方法
而不是直接用0S的参数套用到TriS。
可能原因包括样本来源不同、提取方法不同、Chondroitinase批次和活性不同、酶解时间不同、4S/6S色谱分离程度不同，以及定量响应因子处理方式不同。
不同商业chondroitinase制剂的实际活性也可能存在差异，因此方法验证中应关注酶批次和完全消化程度。
首先检查AMAC是否过量。
其次检查NaBH3CN浓度。
再次检查衍生化后是否需要进一步稀释。
如果背景仍然过高，可以考虑：
AMAC标记完成-净化去除游离AMAC-重新进样
同时需要设置：
AMAC试剂空白-酶空白-溶剂空白
这样可以判断背景到底来自标签、酶还是样本。
如果实验室第一次建立肝素/HS二糖LC-MS方法，建议至少配置8种核心二糖：
0S-NS-6S-2S-NS6S-NS2S-2S6S-TriS
如果进一步研究特殊N-unsubstituted结构，则增加：
IVH-IIIH-IIH-IH
如果需要高精度绝对定量，则建议同时配置：
0S-13C-NS-13C-6S-13C-2S-13C-NS6S-13C-NS2S-13C-2S6S-13C-TriS-13C
基础CS/DS面板建议配置：
0S-4S-6S-2S-2S4S-2S6S-4S6S-TriS
如果研究组织样本，建议额外增加：
HA二糖ΔUA-GlcNAc
这样可以在同一GAG分析体系中同时观察CS/DS和HA。
如果研究重点是高精度CS定量，可以优先配置：
CS-0S-13C-CS-4S-13C-CS-6S-13C-CS-4S6S-13C
如果希望同时建立一个覆盖肝素/HS和CS/DS的靶向GAG平台，可以优先建立17项核心面板。
HS/Heparin部分：
0S-NS-6S-2S-NS6S-NS2S-2S6S-TriS
CS/DS部分：
0S-4S-6S-2S-2S4S-2S6S-4S6S-TriS
HA部分：
ΔUA-GlcNAc
完整流程为：
GAG样本分样-Heparinase I/II/III酶解HS/Heparin-Chondroitinase ABC酶解CS/DS-获得不饱和二糖-AMAC衍生化-LC-MS/MS检测-17种标准品定性定量-稳定同位素内标校正-计算各类GAG含量和硫酸化模式
已有AMAC-LC-MS方法可以在同一分析框架下覆盖多类GAG衍生二糖。
肝素和硫酸软骨素二糖组成分析的核心逻辑，是将高度复杂、结构异质的GAG多糖转换成数量有限、能够准确分离和定量的不饱和二糖。
对于肝素和硫酸乙酰肝素，通常采用Heparinase I、II和III联合酶解，以覆盖高硫酸化和低硫酸化结构域。
对于硫酸软骨素和皮肤素硫酸，可以使用Chondroitinase ABC完成总体CS/DS二糖分析；如果需要进一步区分GlcA型CS和IdoA-rich DS，则可以增加Chondroitinase AC和Chondroitinase B选择性酶解。
一套完整实验流程可以概括为：
生物样本或GAG样品-蛋白消化和GAG富集-脱盐纯化-Heparinase I/II/III或Chondroitinase体系完全酶解-获得ΔUA不饱和二糖-AMAC还原胺化标记-LC-MS/MS分离检测-二糖标准品保留时间和碎片确认-稳定同位素内标校正-标准曲线绝对定量-计算二糖mol%和平均硫酸化程度
肝素/HS建议至少覆盖0S、NS、6S、2S、NS6S、NS2S、2S6S和TriS八种核心二糖；需要更深度结构研究时，可进一步加入N-unsubstituted GlcN相关结构，形成12种经典肝素/HS二糖面板。
CS/DS建议至少检测0S、4S、6S、2S、2S4S、2S6S、4S6S和TriS八种二糖，并根据研究需要加入HA二糖。
对于普通组成分析，可以使用各二糖外标标准曲线；对于血浆、尿液、组织、细胞等复杂基质以及需要跨批次高精度定量的研究，则优先推荐13C标记结构匹配内标。已有研究利用8种13C-HS二糖内标和13C-HS多糖校准物进行全过程定量，也已有13C-CS二糖标准用于CS定量。
需要特别注意，二糖组成分析能够准确描述GAG整体硫酸化组成，却不能完全恢复原多糖链的序列、GlcA/IdoA排列以及复杂蛋白结合结构域。如果研究目标进一步涉及抗凝结合位点、3-O-sulfation、特定寡糖序列或GlcA/IdoA空间排列，则应在二糖组成分析基础上进一步增加寡糖LC-MS/MS、选择性酶解和结构测序。
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| 序列 | 中文名 | 英文名 | CAS | 规格 | 纯度 | 货期 | 品牌 |
| 1 | HS/肝素0S二糖 | ΔUA-GlcNAc / 0S-HS | N/A | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| 2 | HS/肝素NS二糖 | ΔUA-GlcNS / NS-HS | N/A | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| 3 | HS/肝素6S二糖 | ΔUA-GlcNAc6S / 6S-HS | N/A | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| 4 | HS/肝素2S二糖 | ΔUA2S-GlcNAc / 2S-HS | N/A | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| 5 | HS/肝素NS6S二糖 | ΔUA-GlcNS6S / NS6S-HS | N/A | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| 6 | HS/肝素NS2S二糖 | ΔUA2S-GlcNS / NS2S-HS | N/A | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| 7 | HS/肝素2S6S二糖 | ΔUA2S-GlcNAc6S / 2S6S-HS | N/A | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| 8 | HS/肝素三硫酸二糖 | ΔUA2S-GlcNS6S / TriS-HS / IS | N/A | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| 9 | IVA二糖 | ΔUA-GlcNAc / IVA | N/A | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| 10 | IIIA二糖 | ΔUA2S-GlcNAc / IIIA | N/A | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| 11 | IIA二糖 | ΔUA-GlcNAc6S / IIA | N/A | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| 12 | IA二糖 | ΔUA2S-GlcNAc6S / IA | N/A | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| 13 | IVH二糖 | ΔUA-GlcN / IVH | N/A | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| 14 | IIIH二糖 | ΔUA2S-GlcN / IIIH | N/A | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| 15 | IIH二糖 | ΔUA-GlcN6S / IIH | N/A | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| 16 | IH二糖 | ΔUA2S-GlcN6S / IH | N/A | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| 17 | CS 0S二糖 | ΔUA-GalNAc / CS-0S | N/A | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| 18 | CS 4S二糖 | ΔUA-GalNAc4S / CS-4S / ΔDi-4S | N/A | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| 19 | CS 6S二糖 | ΔUA-GalNAc6S / CS-6S / ΔDi-6S | N/A | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| 20 | CS 2S二糖 | ΔUA2S-GalNAc / CS-2S | N/A | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| 21 | CS 2S4S二糖 | ΔUA2S-GalNAc4S / CS-SB / 2S4S | N/A | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| 22 | CS 2S6S二糖 | ΔUA2S-GalNAc6S / CS-SD / 2S6S | N/A | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| 23 | CS 4S6S二糖 | ΔUA-GalNAc4S6S / CS-SE / 4S6S | N/A | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| 24 | CS三硫酸二糖 | ΔUA2S-GalNAc4S6S / CS-TriS | N/A | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| 25 | HA不饱和二糖 | ΔUA-GlcNAc / ΔDi-HA | N/A | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| 26 | 肝素钠 | Heparin sodium | 2608411 | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| 27 | 硫酸乙酰肝素 | Heparan sulfate / HS | N/A | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| 28 | 低分子肝素 | Low molecular weight heparin / LMWH | 混合物/以COA为准 | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| 29 | 硫酸软骨素钠 | Chondroitin sulfate sodium | 2623363 | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| 30 | 硫酸软骨素A | Chondroitin sulfate A / CS-A | 9082-07-9 / 来源待确认 | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| 31 | 硫酸软骨素C | Chondroitin sulfate C / CS-C | N/A | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| 32 | 皮肤素硫酸钠 | Dermatan sulfate sodium / Chondroitin sulfate B | 54328-33-5 | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| 33 | 硫酸软骨素D | Chondroitin sulfate D / CS-D | N/A | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| 34 | 硫酸软骨素E | Chondroitin sulfate E / CS-E | N/A | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| 35 | 透明质酸钠 | Sodium hyaluronate | 9067-32-7 | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| 36 | D-葡萄糖醛酸 | D-Glucuronic acid / GlcA | 1700908 | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| 37 | L-艾杜糖醛酸 | L-Iduronic acid / IdoA | N/A | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| 38 | D-葡萄糖胺盐酸盐 | D-Glucosamine hydrochloride / GlcN HCl | 66-84-2 | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| 39 | N-乙酰-D-葡萄糖胺 | N-Acetyl-D-glucosamine / GlcNAc | 7512-17-6 | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| 40 | D-半乳糖胺盐酸盐 | D-Galactosamine hydrochloride / GalN HCl | 1772-03-8 | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| 41 | N-乙酰-D-半乳糖胺 | N-Acetyl-D-galactosamine / GalNAc | 1811-31-0 | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| 42 | 13C标记0S-HS二糖 | ΔUA-GlcNAc-13C labeled / 0S-HS-13C | N/A | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | isospex® |
| 43 | 13C标记NS-HS二糖 | ΔUA-GlcNS-13C labeled / NS-HS-13C | N/A | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | isospex® |
| 44 | 13C标记6S-HS二糖 | ΔUA-GlcNAc6S-13C labeled / 6S-HS-13C | N/A | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | isospex® |
| 45 | 13C标记2S-HS二糖 | ΔUA2S-GlcNAc-13C labeled / 2S-HS-13C | N/A | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | isospex® |
| 46 | 13C标记NS6S-HS二糖 | ΔUA-GlcNS6S-13C labeled / NS6S-HS-13C | N/A | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | isospex® |
| 47 | 13C标记NS2S-HS二糖 | ΔUA2S-GlcNS-13C labeled / NS2S-HS-13C | N/A | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | isospex® |
| 48 | 13C标记2S6S-HS二糖 | ΔUA2S-GlcNAc6S-13C labeled / 2S6S-HS-13C | N/A | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | isospex® |
| 49 | 13C标记TriS-HS二糖 | ΔUA2S-GlcNS6S-13C labeled / TriS-HS-13C | N/A | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | isospex® |
| 50 | 13C标记硫酸乙酰肝素 | 13C-labeled Heparan sulfate polysaccharide | N/A | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | isospex® |
| 51 | 13C标记CS 0S二糖 | ΔUA-GalNAc-13C / CS-0S-13C | N/A | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | isospex® |
| 52 | 13C标记CS 4S二糖 | ΔUA-GalNAc4S-13C / CS-4S-13C | N/A | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | isospex® |
| 53 | 13C标记CS 6S二糖 | ΔUA-GalNAc6S-13C / CS-6S-13C | N/A | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | isospex® |
| 54 | 13C标记CS 4S6S二糖 | ΔUA-GalNAc4S6S-13C / CS-SE-13C | N/A | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | isospex® |
| 55 | 13C标记CS 2S二糖 | ΔUA2S-GalNAc-13C / CS-2S-13C | N/A | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | isospex® |
| 56 | 13C标记CS 2S4S二糖 | ΔUA2S-GalNAc4S-13C / CS-2S4S-13C | N/A | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | isospex® |
| 57 | 13C标记CS 2S6S二糖 | ΔUA2S-GalNAc6S-13C / CS-2S6S-13C | N/A | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | isospex® |
| 58 | 13C标记CS TriS二糖 | ΔUA2S-GalNAc4S6S-13C / CS-TriS-13C | N/A | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | isospex® |
| 59 | d4-2-氨基苯甲酸 | 2-Aminobenzoic acid-d4 / 2-AA-d4 | N/A | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | isospex® |
| 60 | 2-氨基吖啶酮 | 2-Aminoacridone / AMAC | 27918-14-5 | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| 61 | 2-氨基苯甲酸 | 2-Aminobenzoic acid / 2-AA | 118-92-3 | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| 62 | 氰基硼氢化钠 | Sodium cyanoborohydride | 25895-60-7 | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| 63 | 二甲基亚砜 | Dimethyl sulfoxide / DMSO | 67-68-5 | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| 64 | 乙酸 | Acetic acid | 64-19-7 | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| 65 | 甲酸铵 | Ammonium formate | 540-69-2 | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| 66 | 乙酸铵 | Ammonium acetate | 631-61-8 | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| 67 | 甲醇 | Methanol | 67-56-1 | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| 68 | 乙腈 | Acetonitrile | 27522 | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| 69 | Tris | Tris(hydroxymethyl)aminomethane | 77-86-1 | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| 70 | 乙酸钠 | Sodium acetate | 127-09-3 | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| 71 | 肝素酶I | Heparinase I / Heparin Lyase I | 酶制剂/N/A | 1mg/5mg/10mg | 以COA为准 | 现货 | 实验级 |
| 72 | 肝素酶II | Heparinase II / Heparin Lyase II | 酶制剂/N/A | 1mg/5mg/10mg | 以COA为准 | 现货 | 实验级 |
| 73 | 肝素酶III | Heparinase III / Heparin Lyase III | 酶制剂/N/A | 1mg/5mg/10mg | 以COA为准 | 现货 | 实验级 |
| 74 | 硫酸软骨素酶ABC | Chondroitinase ABC | 9024-13-9 | 1mg/5mg/10mg | 以COA为准 | 现货 | 实验级 |
| 75 | 硫酸软骨素酶AC | Chondroitinase AC | 酶制剂/N/A | 1mg/5mg/10mg | 以COA为准 | 现货 | 实验级 |
| 76 | 硫酸软骨素酶ACII | Chondroitinase AC II | 酶制剂/N/A | 1mg/5mg/10mg | 以COA为准 | 现货 | 实验级 |
| 77 | 硫酸软骨素酶B | Chondroitinase B | 52227-83-5 | 1mg/5mg/10mg | 以COA为准 | 现货 | 实验级 |
