2026-10-08 16:06:16
维生素D并不是单一化合物，而是一组由维生素D2、维生素D3及其多级羟化代谢物组成的脂溶性甾体类物质。
在人体内，维生素D3主要来源于皮肤中7-Dehydrocholesterol经紫外线照射形成，也可以通过食物和补充剂摄入；维生素D2则主要来源于真菌、酵母和部分强化食品。
进入体内以后，维生素D首先在肝脏发生25位羟化，形成25-Hydroxyvitamin D，即25(OH)D；随后在肾脏及部分外周组织中进一步发生1α位羟化，形成具有较强生物活性的1,25-Dihydroxyvitamin D，即1,25(OH)2D。
与此同时，维生素D还会继续进入24位羟化、23位羟化、差向异构化和进一步氧化通路，形成24,25(OH)2D3、3-epi-25(OH)D3、1,24,25(OH)3D3以及Calcitroic acid等多种代谢物。
因此，“维生素D检测”并不等于单纯检测Vitamin D3。
在临床营养、骨代谢、肾脏疾病、甲状旁腺功能、儿童发育、妊娠、免疫、肿瘤、内分泌以及药物代谢研究中，经常需要区分：
Vitamin D2、Vitamin D3、25(OH)D2、25(OH)D3、3-epi-25(OH)D3、24,25(OH)2D3、1,25(OH)2D2和1,25(OH)2D3等不同结构。
其中25(OH)D3和25(OH)D2通常用于评价维生素D营养状态；1,25(OH)2D3和1,25(OH)2D2更适合研究活性维生素D代谢和内分泌调控；24,25(OH)2D3及相关代谢比值可以反映维生素D分解代谢状态；3-epi-25(OH)D3则可能影响婴幼儿和部分特殊人群中总25(OH)D结果的解释。
本文围绕“维生素D及其代谢物检测方案”，系统介绍维生素D代谢通路、样本类型、前处理、蛋白结合释放、液液萃取、SPE净化、LC-MS/MS检测、PTAD等衍生化策略、稳定同位素内标选择、方法学验证以及不同研究目的下的指标组合。
维生素D体系中最常见的两个母体化合物为Vitamin D2和Vitamin D3。
Vitamin D2又称Ergocalciferol。
Vitamin D3又称Cholecalciferol。
二者结构相似，但侧链结构不同，因此在LC-MS/MS中可以分别检测。
人体内更加重要的不是母体Vitamin D，而是它们的羟化代谢物。
常见代谢物包括：
|
类别 |
代表物 |
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母体维生素D |
Vitamin D2、Vitamin D3 |
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主要循环代谢物 |
25(OH)D2、25(OH)D3 |
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活性代谢物 |
1,25(OH)2D2、1,25(OH)2D3 |
|
分解代谢物 |
24,25(OH)2D2、24,25(OH)2D3 |
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差向异构体 |
3-epi-25(OH)D2、3-epi-25(OH)D3 |
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深度代谢物 |
1,24,25(OH)3D3、Calcitroic acid |
|
其他羟化物 |
23,25(OH)2D3、25,26(OH)2D3等 |
不同代谢物反映的是维生素D代谢链条中的不同环节，因此不能简单互相替代。
维生素D3的经典代谢过程可以表示为：
7-Dehydrocholesterol-紫外线照射-Previtamin D3-Vitamin D3-肝脏25位羟化-25(OH)D3-肾脏/外周组织1α羟化-1,25(OH)2D3-进一步24位或其他位点氧化-失活代谢物
Vitamin D2的代谢逻辑基本相似：
Vitamin D2-25(OH)D2-1,25(OH)2D2-进一步氧化代谢
其中25(OH)D是循环中最主要的维生素D储存和评价指标。
1,25(OH)2D具有更高生物活性，但血液浓度远低于25(OH)D，并且受到PTH、FGF23、钙、磷、肾功能和CYP27B1/CYP24A1等多种因素调控。
因此：
评价维生素D营养状态-优先25(OH)D
研究活性维生素D内分泌-重点1,25(OH)2D
这两个概念必须区分。
25(OH)D具有几个重要特点。
第一，在血液中的浓度明显高于1,25(OH)2D。
第二，循环半衰期相对较长。
第三，能够综合反映皮肤合成、饮食摄入和补充剂摄入。
第四，Vitamin D2和Vitamin D3摄入后都会转化成相应25羟化产物。
因此常规营养状态研究通常检测：
25(OH)D2+25(OH)D3
二者之和经常称为Total 25(OH)D。
但是对于科研和高质量LC-MS/MS方法，建议分别报告25(OH)D2和25(OH)D3，而不是只报告总量。
这样可以进一步观察D2和D3补充来源以及不同代谢行为。
1,25(OH)2D是维生素D的活性形式，但是它并不是普通营养状态的最佳指标。
在维生素D不足早期，机体可能通过PTH等机制增加1α羟化，从而维持甚至暂时升高1,25(OH)2D水平。
因此：
25(OH)D下降
并不一定马上伴随：
1,25(OH)2D下降。
1,25(OH)2D更加适合用于：
肾功能异常、甲状旁腺疾病、肉芽肿性疾病、维生素D代谢酶缺陷以及活性维生素D药理研究。
Vitamin D2和Vitamin D3来源不同。
Vitamin D3常来自动物来源食物、皮肤合成和胆钙化醇补充剂。
Vitamin D2常来自Ergocalciferol补充剂、真菌、酵母和某些强化食品。
如果只测总Vitamin D或者总25(OH)D，就无法判断不同来源贡献。
LC-MS/MS的一个重要优势就是能够将：
25(OH)D2-25(OH)D3
分别定量。
这对于营养补充剂研究、药代动力学和不同制剂比较尤其重要。
3-epi-25(OH)D3是25(OH)D3的C3差向异构体。
它与25(OH)D3具有相同分子式和分子量，仅在3位羟基立体构型上存在差异。
因此：
普通质谱母离子质量无法直接区分25(OH)D3和3-epi-25(OH)D3
必须依靠色谱分离。
3-epi-25(OH)D3在婴幼儿以及部分成人样本中均可能存在。
如果方法不能分开二者，可能导致25(OH)D3结果偏高。
因此对于：
儿童、婴幼儿、孕妇、特殊人群和精细维生素D代谢研究
建议将3-epi-25(OH)D3单独分离和定量。
24,25-Dihydroxyvitamin D3是25(OH)D3经CYP24A1进一步羟化形成的重要分解代谢物。
典型通路可以表示为：
25(OH)D3-CYP24A1-24,25(OH)2D3-进一步氧化-维生素D失活代谢
因此24,25(OH)2D3可以反映维生素D分解代谢活性。
越来越多研究会同时检测：
25(OH)D3
和：
24,25(OH)2D3。
进一步计算Vitamin D Metabolite Ratio。
例如：
24,25(OH)2D3/25(OH)D3
这一比例可以辅助评价CYP24A1相关代谢状态。
CYP24A1参与维生素D失活代谢。
如果CYP24A1功能明显降低，24位羟化能力会受到影响。
因此可能出现：
25(OH)D3相对较高
但：
24,25(OH)2D3明显偏低。
所以：
24,25(OH)2D3/25(OH)D3比值
在维生素D代谢异常研究中具有一定价值。
这类研究单纯检测25(OH)D通常不足以解释代谢机制。
1,25(OH)2D在血液中的浓度通常比25(OH)D低几个数量级。
这意味着普通25(OH)D检测方法不能简单直接套用。
主要难点包括：
第一，浓度非常低。
第二，与结合蛋白存在明显结合。
第三，存在D2和D3两种形式。
第四，可能存在结构非常接近的干扰物。
第五，样本量往往有限。
因此1,25(OH)2D分析经常需要：
较大样本量-更强净化-SPE或免疫亲和富集-衍生化-高灵敏LC-MS/MS
血液中的维生素D及其代谢物并不是完全游离存在。
大部分与Vitamin D Binding Protein，简称DBP结合。
少量还与Albumin结合。
因此在样本前处理阶段，需要将维生素D代谢物从蛋白结合状态释放出来。
这也是为什么血清和血浆25(OH)D检测通常不能简单“直接进样”。
前处理需要兼顾：
蛋白释放-蛋白沉淀-目标物回收
都可以。
常规25(OH)D检测常使用血清或血浆。
但是同一研究中应该尽量统一样本类型和抗凝剂。
不同抗凝体系、样本储存条件和处理时间可能影响基质效应和方法表现。
对于建立科研LC-MS/MS平台，建议在方法学验证阶段分别评价：
血清、EDTA血浆和其他实际使用基质。
然后固定一种样本类型。
一个常见LC-MS/MS流程可以设计为：
血清样本-加入25(OH)D2/25(OH)D3稳定同位素内标-释放蛋白结合-蛋白沉淀-离心-液液萃取或SPE净化-氮吹浓缩-复溶-LC-MS/MS-MRM定量
如果采用高灵敏度衍生化方案，则可以变为：
血清样本-加入同位素内标-蛋白沉淀-提取净化-干燥-PTAD或其他Diels-Alder试剂衍生化-复溶-LC-MS/MS
Methanol和Acetonitrile能够使血清蛋白沉淀，并释放部分蛋白结合的小分子。
维生素D及其代谢物具有较强疏水性，因此蛋白沉淀后可以进入有机相或者后续萃取体系。
蛋白沉淀的主要作用是：
释放结合物-去除大部分蛋白-降低离子抑制-为后续LLE/SPE做准备
但简单蛋白沉淀并不一定能满足所有维生素D代谢物检测。
对于1,25(OH)2D和复杂代谢物，通常还需要更强净化或富集。
Vitamin D和多数羟化代谢物具有脂溶性。
因此可以使用Hexane、MTBE或其他有机溶剂进行液液萃取。
典型思路为：
样本蛋白释放-加入有机溶剂-充分混合-维生素D进入有机层-分离有机相-低温氮吹-复溶-LC-MS/MS
LLE的优点是成本低、操作直观。
不足是：
手工操作较多、溶剂消耗较大、不同极性代谢物回收率可能不同。
如果希望同时检测：
25(OH)D、24,25(OH)2D和1,25(OH)2D等多个代谢物
SPE通常更加容易控制净化选择性。
SPE可以减少：
磷脂、胆固醇、中性脂质和其他血浆内源干扰。
典型流程为：
样本+同位素内标-蛋白释放-SPE上样-洗去极性/非目标杂质-洗脱维生素D代谢物-浓缩-复溶-LC-MS/MS
对于高通量临床研究，还可以使用96孔SPE板提高处理效率。
血清和血浆中含有大量磷脂。
蛋白沉淀以后，一部分磷脂仍然留在上清。
如果直接进ESI-MS，容易发生：
离子抑制。
尤其当目标物浓度较低时，磷脂干扰会明显降低灵敏度。
因此对于精确定量方法，建议评估：
Phospholipid removal
或者使用SPE进一步净化。
Vitamin D及部分代谢物疏水性较强，离子化并不是特别容易。
传统维生素D LC-MS/MS方法中经常使用：
APCI。
因为APCI对相对疏水、热稳定的小分子具有较好响应。
随着衍生化方法发展，ESI也被广泛应用。
特别是使用PTAD、DMEQ-TAD或者其他增强离子化的标签以后，ESI灵敏度可以显著提高。
因此：
未衍生化疏水Vitamin D代谢物-APCI具有优势
经过离子化增强衍生化的Vitamin D代谢物-ESI通常非常适合
Vitamin D及部分羟化代谢物本身在ESI中响应不算强。
尤其是：
1,25(OH)2D
浓度极低。
因此需要引入能够增强离子化的化学标签。
Vitamin D结构中含有共轭二烯结构，可以与Diels-Alder型试剂发生反应。
这为PTAD等衍生化提供了基础。
PTAD全称：
4-Phenyl-1,2,4-triazoline-3,5-dione。
它是Vitamin D LC-MS分析中非常经典的衍生化试剂。
PTAD可以与维生素D共轭二烯发生Diels-Alder反应。
衍生化以后通常能够提高：
离子化效率、质谱响应和低丰度代谢物检测能力。
典型流程为：
维生素D代谢物提取-干燥-加入PTAD反应液-完成Diels-Alder衍生化-终止或稀释反应-LC-MS/MS
PTAD特别适合：
25(OH)D、1,25(OH)2D以及其他低丰度Vitamin D metabolites。
PTAD反应速度较快，但方法开发仍需要控制：
PTAD浓度、反应溶剂、反应时间、温度、残余水分以及反应终止条件。
另外，PTAD与Vitamin D反应后可能形成不同面加成产物。
因此色谱中可能出现：
多个衍生化峰
或者：
峰形变化。
方法开发时必须使用标准品确认。
Vitamin D分析中还可以使用其他Diels-Alder类标签。
例如：
DMEQ-TAD。
另外也存在商业化Vitamin D增强型衍生化试剂体系。
不同衍生化试剂的目标相同：
提高Vitamin D metabolites的离子化效率和LC-MS/MS灵敏度
选择时应考虑：
仪器平台、目标代谢物、样本量、是否需要高通量以及对应标准品可获得性。
二者分子量完全相同。
所以必须依靠色谱。
方法开发流程可以采用：
25(OH)D3单标进样-3-epi-25(OH)D3单标进样-记录保留时间-混标进样-优化色谱柱和梯度-确认基线或足够分离-再进入样本分析
如果方法无法分离：
25(OH)D3
和：
3-epi-25(OH)D3
则不能声称是完全特异的25(OH)D3定量。
相比C3 epimer，25(OH)D2和25(OH)D3结构差异更大。
二者分子量不同，因此LC-MS/MS中相对容易区分。
但是仍需要建立：
不同MRM transition
以及对应稳定同位素内标。
不建议用一个25(OH)D3-d6同时校正所有D2和D3代谢物。
普通维生素D营养状态一般以25(OH)D为主。
但是以下研究中，母体D2/D3仍然有价值：
补充剂药代动力学、食品强化、肠道吸收、制剂生物利用度、动物实验以及Vitamin D代谢动力学研究。
典型指标组合可以是：
Vitamin D2-Vitamin D3-25(OH)D2-25(OH)D3
这样可以观察：
摄入-吸收-25羟化
整个早期代谢过程。
虽然二者都具有活性Vitamin D作用，但来源不同。
1,25(OH)2D2来自Vitamin D2代谢。
1,25(OH)2D3来自Vitamin D3代谢。
在普通人群中，1,25(OH)2D3通常更加主要。
如果研究Vitamin D2补充、Ergocalciferol制剂或者特殊营养干预，则有必要将两者分开。
对于普通临床科研和营养研究，可以首先建立4项面板：
25(OH)D2-25(OH)D3-3-epi-25(OH)D2-3-epi-25(OH)D3
如果主要研究成人常规样本，也可以先建立：
25(OH)D2-25(OH)D3-3-epi-25(OH)D3
这一组合已经能够显著提高25(OH)D分析的结构特异性。
在基础25(OH)D方法稳定以后，可以进一步增加：
24,25(OH)2D2、24,25(OH)2D3、1,25(OH)2D2、1,25(OH)2D3、23,25(OH)2D3、25,26(OH)2D3以及1,24,25(OH)3D3。
完整扩展流程可以表示为：
Vitamin D2/D3-25(OH)D2/D3-3-epi-25(OH)D-24,25(OH)2D-1,25(OH)2D-其他深度羟化物
这样能够从营养状态扩展到：
代谢通路研究。
维生素D研究中可以通过代谢物之间的比例反映某些酶通路。
例如：
24,25(OH)2D3/25(OH)D3
常用于反映Vitamin D 24-hydroxylation相关代谢。
还可以根据研究目的计算其他代谢物比值。
但需要注意：
比值只有在两个代谢物都被可靠定量的前提下才有意义。
如果24,25(OH)2D3接近LLOQ，简单计算比值可能导致较大误差。
建议尽量减少不必要的强光暴露。
Vitamin D体系中存在光异构和光降解相关化学过程。
尤其在母体Vitamin D、Previtamin D、Lumisterol和Tachysterol等研究中，更应该重视光照影响。
典型样本管理可以采用：
采样-避强光-低温处理-分装-长期冻存-分析时一次解冻
不建议频繁冻融。
虽然部分Vitamin D代谢物相对稳定，但重复冻融会增加：
样本基质变化、吸附、氧化和前处理差异。
较好的做法是样本采集后直接分装。
流程为：
一次采样-分装多个小体积冻存管-每次实验取一个冻存管-避免同一样本反复冻融
Vitamin D体系结构非常复杂。
除了：
D2和D3
还存在：
Previtamin D、Lumisterol、Tachysterol、C3 epimer以及多个位置羟化异构体。
因此标准品采购时不能只看中文名。
必须确认：
母体结构、D2/D3类型、羟基位置、立体构型以及是否为C3 epimer。
Vitamin D LC-MS/MS最理想的定量策略是：
一个目标物对应一个结构匹配的稳定同位素内标。
例如：
25(OH)D3对应25(OH)D3-d6。
25(OH)D2对应25(OH)D2-d3或其他明确标记形式。
1,25(OH)2D3对应1,25(OH)2D3-d6。
24,25(OH)2D3对应24,25(OH)2D3-d6。
典型定量逻辑为：
样本-提取前加入同位素内标-前处理-衍生化-LC-MS/MS-目标物/内标峰面积比-标准曲线-计算实际浓度
如果内标在最终复溶以后加入，只能校正：
进样量和质谱响应。
却不能校正：
蛋白释放、LLE/SPE回收、蒸干损失、吸附以及衍生化效率。
因此更加理想的方式是：
样本分取后尽早加入稳定同位素内标-随后与目标物一起经历整个前处理过程
这样能够最大限度模拟目标物损失。
不建议。
25(OH)D3、1,25(OH)2D3和24,25(OH)2D3之间羟基数量不同。
这会影响：
提取效率、SPE行为、LC保留和离子化效率。
D2和D3侧链也不同。
因此高质量方法应尽量使用对应结构内标。
如果商业可获得性或成本受限，可以使用类别内标，但必须在方法验证中证明替代内标足够可靠。
对于25(OH)D2和25(OH)D3，可以根据预期样本范围建立多点校准曲线。
对于1,25(OH)2D，浓度范围明显更低，不能简单沿用25(OH)D的曲线范围。
标准曲线建立逻辑为：
标准品母液-逐级稀释-加入固定量稳定同位素内标-按照样本相同前处理-必要时衍生化-LC-MS/MS-目标物/内标峰面积比-加权回归
对于生物样本，建议采用：
基质匹配校准物
或者经过充分验证的替代基质。
血清样本存在明显基质。
磷脂、胆固醇、蛋白残留和其他甾体都可能影响离子化。
如果标准曲线完全在纯溶剂中建立，而样本来自血清，就可能出现：
标准与样本基质不一致。
因此方法验证阶段必须评估：
基质效应。
稳定同位素内标能够明显减少这一问题，但不能完全代替基质效应验证。
Vitamin D代谢物结构已经明确，因此Triple Quadrupole的MRM非常适合靶向定量。
方法开发流程可以采用：
标准品直接进样-确定前体离子-优化产物离子-建立MRM transition-优化碰撞能-确定保留时间-匹配稳定同位素内标-建立标准曲线
MRM具有：
高灵敏度、高选择性和高通量
等优势。
因此特别适合大批量血清Vitamin D代谢物检测。
如果研究的是：
Vitamin D metabolome
而不是几个固定指标，就可以考虑Orbitrap或QTOF。
例如研究：
未知羟化代谢物、光异构体、药物干预后的新代谢物以及非经典Vitamin D代谢通路。
典型路线为：
血清/组织提取-LC-HRMS非靶向检测-准确质量筛选Vitamin D相关离子-MS/MS解析-候选代谢物筛选-购买标准品-靶向验证
HRMS适合发现。
Triple Quadrupole适合成熟靶向定量。
常规Vitamin D营养状态主要使用血清或血浆。
尿液并不是25(OH)D常规首选样本。
但是尿液中可以研究某些Vitamin D代谢产物及其结合型产物。
如果课题涉及：
Vitamin D排泄、肾脏代谢或者特殊代谢物
可以建立尿液LC-MS方法。
但不能直接将血清25(OH)D参考思路简单套用到尿液。
组织中Vitamin D及其代谢物浓度、结合状态和基质复杂程度与血液不同。
常见组织包括：
肝脏、肾脏、脂肪组织、胎盘、骨组织和肿瘤组织。
典型流程可以设计为：
组织快速取材-低温称重-低温匀浆-加入稳定同位素内标-有机溶剂提取-离心-液液萃取或SPE-浓缩-必要时PTAD衍生化-LC-MS/MS
结果通常需要按照：
组织重量或者蛋白量
归一化。
Vitamin D属于脂溶性物质。
脂肪组织可以作为Vitamin D的储存库之一。
因此肥胖、减重、脂肪动员和Vitamin D补充研究中，可以进一步分析：
Vitamin D3、25(OH)D3及相关代谢物
在脂肪组织中的变化。
但是脂肪组织中大量TG和其他中性脂质会造成明显基质干扰，因此前处理通常需要比血清更强的净化。
细胞研究通常并不仅仅检测培养液中的Vitamin D。
还可以研究细胞是否具备：
CYP2R1、CYP27B1、CYP24A1
等相关代谢能力。
典型实验可以设计为：
细胞培养-加入Vitamin D3或25(OH)D3-设置不同时间点-收集培养上清-收集细胞-加入稳定同位素内标-分别提取-LC-MS/MS-观察底物减少和代谢物生成
如果25(OH)D3转化为1,25(OH)2D3，就可以反映细胞1α-hydroxylation能力。
如果研究Vitamin D3制剂，可以建立：
Vitamin D3-25(OH)D3-24,25(OH)2D3
三个层级。
如果研究Vitamin D2制剂，则检测：
Vitamin D2-25(OH)D2-24,25(OH)2D2
如果进一步研究活性代谢，可以加入：
1,25(OH)2D。
这样可以同时观察：
吸收-肝脏25羟化-活化/失活代谢。
肾脏是经典1α羟化的重要部位。
因此肾功能异常可能影响：
25(OH)D向1,25(OH)2D转化。
这类研究可以重点检测：
25(OH)D3、25(OH)D2、1,25(OH)2D3、1,25(OH)2D2和24,25(OH)2D3。
同时结合：
PTH、钙、磷、FGF23和肾功能指标
进行解释。
基础骨代谢研究可以优先检测：
25(OH)D2、25(OH)D3。
如果涉及更深入机制，可以加入：
1,25(OH)2D3和24,25(OH)2D3。
进一步结合：
PTH、Ca、P、ALP、P1NP、CTX以及骨密度
可以更完整评价Vitamin D与骨代谢之间的关系。
婴幼儿样本中3-epi-25(OH)D3比例可能相对较高。
如果检测方法无法将其与25(OH)D3分开，就可能高估真正25(OH)D3水平。
因此儿童Vitamin D研究建议优先建立：
25(OH)D2-25(OH)D3-3-epi-25(OH)D2-3-epi-25(OH)D3
至少应能够分开3-epi-25(OH)D3。
不同实验室和不同方法之间的Vitamin D结果可能存在差异。
尤其涉及：
免疫法、LC-MS/MS、不同校准物和不同样本前处理。
因此实验室内部需要设置：
低浓度QC、中浓度QC和高浓度QC。
大型研究还应尽量使用具有赋值的参考材料进行方法一致性评价。
Vitamin D LC-MS/MS方法通常需要验证：
线性范围、LLOQ、准确度、批内精密度、批间精密度、提取回收率、基质效应、Carryover、选择性、冻融稳定性、短期稳定性、自动进样器稳定性以及长期冻存稳定性。
如果使用PTAD等衍生化，还需要额外验证：
衍生化效率-衍生物稳定性-衍生化批次重复性
Vitamin D方法最重要的选择性挑战之一是结构异构体。
特别应该验证：
25(OH)D3与3-epi-25(OH)D3。
必要时还应关注：
其他位置羟化异构体。
验证流程可以采用：
目标物单标-潜在干扰物单标-混合标准品-观察保留时间和分离度-加入真实血清验证
很多实验只观察目标物结果，却忽略稳定同位素内标本身。
实际上内标响应是非常重要的质量控制指标。
如果某一个样本中的25(OH)D3-d6峰面积明显低于其他样本，可能提示：
提取异常、SPE堵塞、离子抑制、衍生化失败或者进样异常。
因此应该为内标响应设置合理接受范围。
首先检查是否将3-epi-25(OH)D3计入了25(OH)D3。
其次检查色谱是否存在其他共洗脱Vitamin D代谢物。
再次检查标准曲线、内标和基质效应。
如果使用免疫法与LC-MS比较出现偏差，也可能来自抗体交叉反应和不同代谢物识别差异。
最常见原因是浓度过低。
需要检查：
样本量是否足够、SPE或免疫富集回收率、PTAD衍生化是否充分、仪器灵敏度、离子源参数以及对应稳定同位素内标响应。
1,25(OH)2D最好单独建立高灵敏方法，而不是简单附加在普通25(OH)D方法后面。
PTAD与Vitamin D共轭二烯加成后可能形成不同立体加成产物。
因此一个Vitamin D标准品可能出现两个相关衍生峰。
方法开发时需要根据标准品确认：
是否合并积分
还是：
选择其中主要峰定量。
必须在整个方法中保持一致。
因为Vitamin D2和D3侧链结构不同。
即使化学性质相近，其色谱保留和MS响应仍可能存在差异。
因此高质量方法建议：
25(OH)D2使用对应D2同位素内标。
25(OH)D3使用对应D3同位素内标。
可能原因包括：
标准品来源不同、校准方式不同、C3-epimer是否分离、前处理回收不同、衍生化方式不同、离子源不同、基质效应处理不同以及参考体系不同。
因此跨实验室比较时，需要明确：
检测的是Total 25(OH)D还是分别的D2/D3
以及：
是否排除了3-epi-25(OH)D3
基础营养状态面板建议配置：
Vitamin D2-Vitamin D3-25(OH)D2-25(OH)D3-3-epi-25(OH)D2-3-epi-25(OH)D3
扩展代谢面板进一步增加：
24,25(OH)2D2-24,25(OH)2D3-1,25(OH)2D2-1,25(OH)2D3
深度代谢研究可以再增加：
23,25(OH)2D3-25,26(OH)2D3-1,24,25(OH)3D3-Calcitroic acid
基础内标组合建议：
Vitamin D3-d3/d6-25(OH)D3-d6-25(OH)D2-d3或相应标记物
如果需要C3 epimer定量，进一步增加：
3-epi-25(OH)D3稳定同位素内标
扩展面板建议加入：
24,25(OH)2D3-d6-1,25(OH)2D3-d6-1,25(OH)2D2稳定同位素内标
这样可以覆盖从母体到主要活性和失活代谢物。
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研究目的 |
推荐检测指标 |
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常规营养状态 |
25(OH)D2、25(OH)D3 |
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儿童/婴幼儿 |
25(OH)D2、25(OH)D3、3-epi-25(OH)D3 |
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Vitamin D3补充 |
Vitamin D3、25(OH)D3、24,25(OH)2D3 |
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Vitamin D2补充 |
Vitamin D2、25(OH)D2、24,25(OH)2D2 |
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肾脏疾病 |
25(OH)D、1,25(OH)2D、24,25(OH)2D |
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CYP24A1研究 |
25(OH)D3、24,25(OH)2D3及代谢比值 |
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骨代谢 |
25(OH)D2、25(OH)D3，必要时1,25(OH)2D |
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药代动力学 |
Vitamin D2/D3、25(OH)D2/D3及下游代谢物 |
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深度代谢组 |
多级羟化Vitamin D metabolites |
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细胞代谢 |
底物Vitamin D/25(OH)D及生成的1,25/24,25代谢物 |
如果实验室第一次建立血清Vitamin D LC-MS/MS检测，可以优先从：
25(OH)D2-25(OH)D3-3-epi-25(OH)D3
开始。
完整流程建议：
血清样本-加入25(OH)D2和25(OH)D3稳定同位素内标-蛋白结合释放-蛋白沉淀-液液萃取或SPE净化-浓缩-必要时PTAD衍生化-C18 LC分离-Triple Quadrupole MRM检测-分别定量25(OH)D2和25(OH)D3-单独报告3-epi-25(OH)D3
基础方法稳定以后，再增加：
24,25(OH)2D3
最后单独建立：
1,25(OH)2D2/1,25(OH)2D3高灵敏方法
这种分层开发方式通常比一次性把所有Vitamin D代谢物加入同一个方法更加稳妥。
维生素D检测的核心并不是简单测量Vitamin D3，而是根据研究目的选择合适的代谢层级。
对于常规营养状态评价，25(OH)D2和25(OH)D3是最重要的基础指标。
对于儿童、婴幼儿和高精度Vitamin D研究，应进一步区分3-epi-25(OH)D3，避免C3 epimer对25(OH)D3定量造成影响。
对于Vitamin D分解代谢研究，可以加入24,25(OH)2D3，并结合25(OH)D3计算代谢比值。
对于活性Vitamin D、肾脏功能和内分泌研究，则需要单独建立1,25(OH)2D2和1,25(OH)2D3的高灵敏检测方法。
一个完整Vitamin D LC-MS/MS技术路线可以概括为：
样本设计-血清/血浆采集-低温分装保存-样本分取-尽早加入稳定同位素内标-释放DBP结合-蛋白沉淀-液液萃取或SPE净化-低温浓缩-必要时PTAD或其他增强型衍生化-反相LC分离-APCI或ESI-MS/MS检测-区分D2/D3及C3 epimer-稳定同位素内标校正-标准曲线绝对定量-QC和方法学验证
对于基础实验室，可以先建立25(OH)D2、25(OH)D3和3-epi-25(OH)D3三项方法。
对于深入Vitamin D代谢研究，再逐步增加24,25(OH)2D3、1,25(OH)2D3、1,25(OH)2D2以及其他深度代谢物。
在定量策略方面，应尽量采用结构匹配的稳定同位素内标，并在样本前处理早期加入，使其与目标物共同经历蛋白释放、萃取、SPE、蒸干、衍生化和LC-MS/MS检测过程。
只有同时解决结构异构体、低丰度代谢物、基质效应和样本前处理回收率问题，才能获得具有真正生物学和临床研究价值的Vitamin D代谢数据。
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| 产品类别 | 中文名 | 英文名 | CAS | 规格 | 纯度 | 货期 | 品牌 |
| 母体维生素D标准品 | 维生素D2 | Vitamin D2 / Ergocalciferol | 50-14-6 | 10mg/50mg/100mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| 母体维生素D标准品 | 维生素D3 | Vitamin D3 / Cholecalciferol | 67-97-0 | 10mg/50mg/100mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| 维生素D前体标准品 | 7-脱氢胆固醇 | 7-Dehydrocholesterol | 434-16-2 | 10mg/50mg/100mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| 维生素D前体标准品 | 麦角固醇 | Ergosterol | 57-87-4 | 10mg/50mg/100mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| 光异构体标准品 | 前维生素D3 | Previtamin D3 | N/A | 10mg/50mg/100mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| 光异构体标准品 | 光甾醇3 | Lumisterol 3 | 474-69-1 / 待确认 | 10mg/50mg/100mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| 光异构体标准品 | 速甾醇3 | Tachysterol 3 | N/A | 10mg/50mg/100mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| 主要循环代谢物标准品 | 25-羟基维生素D2 | 25-Hydroxyvitamin D2 / 25(OH)D2 | 21343-40-8 | 10mg/50mg/100mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| 主要循环代谢物标准品 | 25-羟基维生素D3 | 25-Hydroxyvitamin D3 / Calcifediol | 19356-17-3 | 10mg/50mg/100mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| C3差向异构体标准品 | 3-epi-25-羟基维生素D2 | 3-epi-25-Hydroxyvitamin D2 | N/A | 10mg/50mg/100mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| C3差向异构体标准品 | 3-epi-25-羟基维生素D3 | 3-epi-25-Hydroxyvitamin D3 | N/A | 10mg/50mg/100mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| 活性维生素D标准品 | 1α,25-二羟基维生素D2 | 1α,25-Dihydroxyvitamin D2 / 1,25(OH)2D2 | 60133-18-8 / 待确认 | 10mg/50mg/100mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| 活性维生素D标准品 | 1α,25-二羟基维生素D3 | 1α,25-Dihydroxyvitamin D3 / Calcitriol | 32222-06-3 | 10mg/50mg/100mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| 24羟化代谢物标准品 | 24,25-二羟基维生素D2 | 24,25-Dihydroxyvitamin D2 | N/A | 10mg/50mg/100mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| 24羟化代谢物标准品 | 24R,25-二羟基维生素D3 | 24R,25-Dihydroxyvitamin D3 | 55721-11-4 / 待确认 | 10mg/50mg/100mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| 24羟化代谢物标准品 | 24S,25-二羟基维生素D3 | 24S,25-Dihydroxyvitamin D3 | N/A | 10mg/50mg/100mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| 其他二羟化代谢物 | 23,25-二羟基维生素D3 | 23,25-Dihydroxyvitamin D3 | N/A | 10mg/50mg/100mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| 其他二羟化代谢物 | 25,26-二羟基维生素D3 | 25,26-Dihydroxyvitamin D3 | N/A | 10mg/50mg/100mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| 其他二羟化代谢物 | 1α,24-二羟基维生素D3 | 1α,24-Dihydroxyvitamin D3 | N/A | 10mg/50mg/100mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| 三羟化代谢物标准品 | 1α,24R,25-三羟基维生素D3 | 1α,24R,25-Trihydroxyvitamin D3 | N/A | 10mg/50mg/100mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| 深度代谢物标准品 | Calcitroic acid | Calcitroic acid | N/A | 10mg/50mg/100mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| 非经典代谢物标准品 | 20-羟基维生素D3 | 20-Hydroxyvitamin D3 / 20(OH)D3 | N/A | 10mg/50mg/100mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| 非经典代谢物标准品 | 20,23-二羟基维生素D3 | 20,23-Dihydroxyvitamin D3 | N/A | 10mg/50mg/100mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| 非经典代谢物标准品 | 20,22-二羟基维生素D3 | 20,22-Dihydroxyvitamin D3 | N/A | 10mg/50mg/100mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| 非经典代谢物标准品 | 20-羟基维生素D2 | 20-Hydroxyvitamin D2 | N/A | 10mg/50mg/100mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| Vitamin D类别参考标准 | 胆固醇 | Cholesterol | 57-88-5 | 10mg/50mg/100mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| Vitamin D类别参考标准 | 7α-羟基胆固醇 | 7α-Hydroxycholesterol | N/A | 10mg/50mg/100mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| 稳定同位素内标 | 维生素D2-d3 | Vitamin D2-d3 | N/A | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | isospex® |
| 稳定同位素内标 | 维生素D3-d3 | Vitamin D3-d3 | N/A | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | isospex® |
| 稳定同位素内标 | 维生素D3-d6 | Vitamin D3-d6 | N/A | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | isospex® |
| 25(OH)D内标 | 25-羟基维生素D2-d3 | 25-Hydroxyvitamin D2-d3 | N/A | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | isospex® |
| 25(OH)D内标 | 25-羟基维生素D2-d6 | 25-Hydroxyvitamin D2-d6 | N/A | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | isospex® |
| 25(OH)D内标 | 25-羟基维生素D3-d3 | 25-Hydroxyvitamin D3-d3 | N/A | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | isospex® |
| 25(OH)D内标 | 25-羟基维生素D3-d6 | 25-Hydroxyvitamin D3-d6 | N/A | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | isospex® |
| 25(OH)D内标 | 25-羟基维生素D3-13C5 | 25-Hydroxyvitamin D3-13C5 | N/A | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | isospex® |
| C3 epimer内标 | 3-epi-25-羟基维生素D3-d3 | 3-epi-25-Hydroxyvitamin D3-d3 | N/A | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | isospex® |
| C3 epimer内标 | 3-epi-25-羟基维生素D3-d6 | 3-epi-25-Hydroxyvitamin D3-d6 | N/A | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | isospex® |
| 活性Vitamin D内标 | 1,25-二羟基维生素D2-d6 | 1,25-Dihydroxyvitamin D2-d6 | N/A | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | isospex® |
| 活性Vitamin D内标 | 1,25-二羟基维生素D3-d6 | 1,25-Dihydroxyvitamin D3-d6 | N/A | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | isospex® |
| 活性Vitamin D内标 | 1,25-二羟基维生素D3-d3 | 1,25-Dihydroxyvitamin D3-d3 | N/A | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | isospex® |
| 24,25(OH)2D内标 | 24,25-二羟基维生素D3-d6 | 24,25-Dihydroxyvitamin D3-d6 | N/A | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | isospex® |
| 24,25(OH)2D内标 | 24,25-二羟基维生素D2-d6 | 24,25-Dihydroxyvitamin D2-d6 | N/A | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | isospex® |
| 深度代谢内标 | 1,24,25-三羟基维生素D3-d标记物 | 1,24,25-Trihydroxyvitamin D3-d labeled | N/A | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货/定制 | isospex® |
| 前体同位素内标 | 7-脱氢胆固醇-d7 | 7-Dehydrocholesterol-d7 | N/A | 1mg/5mg/10mg | ≥98% | 现货 | isospex® |
| Vitamin D衍生化试剂 | PTAD | 4-Phenyl-1,2,4-triazoline-3,5-dione | 4233-33-4 | 10mg/50mg/100mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
| Vitamin D衍生化试剂 | DMEQ-TAD | DMEQ-TAD | N/A | 10mg/50mg/100mg | ≥98% | 现货 | sogestandard® |
