在 LC-MS/MS、GC-MS、靶向代谢组学、脂质组学、药物浓度检测、临床代谢标志物分析等实验中，血浆、尿液和组织样本是最常见的三类生物样本。由于三类样本的基质组成、前处理方式和代谢物稳定性差异较大，同位素内标的加入方式、加入时间和使用策略也需要有所区别。

稳定同位素内标通常与目标物具有高度相似的化学结构和质谱响应特征，可用于校正样本前处理损失、基质效应、进样误差和仪器响应波动。对于靶向代谢组学而言，使用稳定同位素内标有助于补偿基质效应，使不同生物样本、不同批次和不同研究队列之间的数据更具有可比性。

一、同位素内标为什么要按样本类型分别使用？

血浆、尿液和组织样本虽然都属于生物样本，但它们的实验难点并不一样。

LC-MS 分析中，样本基质中的共洗脱组分可能影响目标物离子化，导致离子抑制或增强；稳定同位素内标是否能有效补偿这种基质效应，很大程度取决于内标与目标物是否具有良好的共洗脱行为。

二、同位素内标使用的基本原则

1. 优先在前处理早期加入

同位素内标越早加入，越能校正完整实验流程中的损失。如果内标在样本提取后才加入，只能校正进样误差和仪器响应波动，不能校正样本沉淀、萃取、离心、转移、浓缩和复溶过程中的损失。

推荐原则是：

2. 内标应尽量与目标物结构一致

最理想的内标是目标物本身的稳定同位素标记物。例如检测乳酸时选择乳酸-¹³C₃，检测胆酸时选择胆酸-d₄，检测氨基酸时选择对应的 ¹³C 或 ¹³C/¹⁵N 氨基酸内标。稳定同位素内标通常用于补偿样本制备、色谱和质谱响应变化，尤其是基质效应造成的信号改变。

3. 内标浓度要稳定且适中

内标浓度不能过高，也不能太低。过高可能造成离子抑制或影响低丰度目标物检测；过低则可能导致内标峰不稳定。一般建议内标响应处于方法线性范围内，并接近样本中目标物常见响应水平。

4. 所有样本体系必须一致

同一批实验中，标准曲线、质控样本、空白样本和真实样本应加入相同体积、相同浓度的内标工作液。否则，目标物/内标峰面积比无法准确比较。

三、血浆 / 血清样本中同位素内标的使用方法

1. 血浆样本的特点

血浆和血清中含有大量蛋白、磷脂、脂蛋白、盐类和内源性代谢物。对于 LC-MS/MS 分析而言，血浆样本最常见的问题是蛋白沉淀不完全、磷脂残留、目标物回收率波动以及强基质效应。

血浆样本尤其适合使用稳定同位素内标，因为目标物和内标共同经历蛋白沉淀、离心、转移和进样过程后，可以有效降低前处理差异带来的误差。

2. 推荐加入时间

血浆样本中，同位素内标建议在 蛋白沉淀前加入。

推荐流程如下：

3. 使用注意事项

血浆样本中，内标最好不要在沉淀完成后才加入。因为此时蛋白沉淀造成的目标物损失已经发生，后加入的内标无法校正这部分损失。

另外，血浆中磷脂常引起明显离子抑制。如果目标物处于磷脂洗脱区域，应通过优化色谱条件、改进样本净化方式或选择共洗脱更好的稳定同位素内标来降低影响。Waters 的技术资料提示，稳定同位素内标补偿基质效应的能力依赖于其与未标记目标物的共洗脱情况；若不共洗脱，补偿能力会下降。

4. 血浆样本适用场景

血浆/血清样本中，同位素内标常用于：

四、尿液样本中同位素内标的使用方法

1. 尿液样本的特点

尿液样本蛋白含量通常低于血浆，但盐分、尿素、肌酐、有机酸、氨基酸、药物代谢物和肠道菌群来源代谢物含量丰富。尿液样本的最大特点是个体差异明显，不同样本之间尿比重、pH、盐浓度和代谢物浓度差异很大。

尿液有时可以直接稀释后进样，也可以经过离心、过滤、固相萃取、衍生化或浓缩后检测。针对尿液靶向代谢组学，有研究强调从样本收集到定量分析都需要关注稳定性、基质影响和定量策略。

2. 推荐加入时间

尿液样本中，同位素内标建议在 稀释、离心或萃取前加入。

推荐流程如下：

如果尿液样本只做简单稀释，内标应在稀释前加入；如果需要固相萃取，内标应在上样前加入；如果需要衍生化，内标通常应在衍生化前加入，以校正衍生化效率差异。

3. 使用注意事项

尿液样本中盐浓度变化较大，容易影响电喷雾离子化效率。因此，即使样本处理流程较简单，也建议加入同位素内标进行校正。

尿液样本还常用肌酐校正、尿比重校正或渗透压校正来处理样本浓缩程度差异。但需要注意，肌酐校正不能替代同位素内标校正。肌酐校正主要处理尿液稀释程度差异，而同位素内标主要校正前处理损失、基质效应和仪器响应波动。

4. 尿液样本适用场景

尿液样本中，同位素内标常用于：

五、组织样本中同位素内标的使用方法

1. 组织样本的特点

组织样本比血浆和尿液更复杂。不同组织的含水量、脂质含量、蛋白含量、细胞密度和酶活性不同，代谢物分布也不均匀。例如肝脏、脑、肌肉、肿瘤、肾脏和脂肪组织的代谢特征差异很大。

组织样本处理中，最关键的问题包括：

因此，组织样本中使用同位素内标尤为重要。

2. 推荐加入时间

组织样本中，同位素内标建议在 匀浆前、匀浆时或提取溶剂中加入。

推荐流程如下：

3. 为什么组织样本更建议早加内标？

组织样本匀浆和提取过程中的误差通常比血浆、尿液更大。如果内标在组织已经匀浆并离心后才加入，就无法校正匀浆不完全、代谢物释放不充分、吸附损失和提取效率差异。

因此，组织样本更推荐将内标直接加入预冷提取溶剂中，使内标从提取开始就参与整个流程。

4. 组织样本使用注意事项

组织样本处理时要特别注意低温。许多代谢物周转速度快，采样后如果不及时淬灭，可能导致代谢物含量发生变化。代谢组学和脂质组学样本制备中，有效提取和样本处理对后续 LC-MS 分析非常关键，尤其要尽量减少不需要的基质干扰并保持代谢物稳定。

组织样本还需要明确最终结果的归一化方式。常见方式包括：

需要注意，组织质量归一化和内标校正解决的是不同问题，二者不能互相替代。

5. 组织样本适用场景

组织样本中，同位素内标常用于：

六、三类样本的内标加入方法对比

七、不同检测平台中的内标使用要点

1. LC-MS/MS

LC-MS/MS 是靶向代谢组学中最常用的平台。内标通常用于建立标准曲线，以目标物峰面积与内标峰面积的比值作为响应值。对于复杂基质样本，如果存在明显基质效应，稳定同位素内标通常是优先选择；且内标与目标物色谱峰重叠越好，基质效应补偿越充分。

2. GC-MS

GC-MS 常用于有机酸、脂肪酸、氨基酸、糖类等衍生化分析。若目标物需要衍生化，内标最好在衍生化前加入，这样可以校正衍生化效率差异。

3. HRMS / 高分辨质谱

高分辨质谱可用于更复杂的代谢物识别和同位素峰解析，但定量实验中仍建议使用稳定同位素内标。高分辨并不等于不需要内标，因为基质效应和前处理损失仍然存在。

八、常见错误做法

1. 内标加得太晚

这是最常见问题。如果目标物在沉淀、萃取或匀浆过程中已经损失，提取后再加入内标无法校正这部分误差。

2. 所有代谢物只用一个内标

一个内标通常不能代表所有代谢物。代谢组学实验中，氨基酸、有机酸、脂质、胆汁酸和核苷酸的化学性质差异很大，建议按类别配置多个同位素内标。

3. 忽略样本基质差异

血浆、尿液和组织样本的基质完全不同。即使用同一种目标物方法，也需要分别验证基质效应和回收率。

4. 忽略内标与目标物是否共洗脱

稳定同位素内标不是“只要质量不同就能用”。如果内标和目标物保留时间差异明显，对基质效应的校正能力会下降。

5. 忽略盐型和分子量

很多同位素内标存在盐酸盐、钠盐、水合物或游离酸形式。配制储备液时必须按实际产品形式计算浓度。

九、方法开发中建议验证的内容

在正式检测血浆、尿液和组织样本前，建议验证以下内容：

在靶向代谢组学方法中，从代谢物面板选择、内标选择到质控设置都属于方法建立的重要环节，稳定同位素内标可帮助提高不同样本和研究队列之间的比较准确性。

十、智溯科（ZSK）总结

同位素内标在血浆、尿液和组织样本中的使用方法，应根据样本基质和前处理流程进行设计。血浆样本建议在蛋白沉淀前加入内标，重点校正蛋白沉淀损失和磷脂基质效应；尿液样本建议在稀释、离心或萃取前加入内标，重点校正盐效应、稀释误差和离子化波动；组织样本建议在匀浆前或提取溶剂中加入内标，重点校正匀浆差异、提取损失和复杂组织基质效应。

对于靶向代谢组学和 LC-MS/MS 定量实验来说，稳定同位素内标不仅是实验中的“参照物”，更是提高数据准确性、重复性和批间可比性的关键工具。合理的内标加入时间、浓度设置、样本归一化方式和方法学验证，是获得可靠代谢组学数据的重要基础。