C13-Glucose，即 ¹³C 标记葡萄糖，是代谢流分析、稳定同位素示踪代谢组学和靶向代谢组学研究中最常用的碳源示踪剂之一。通过将普通培养体系或动物体内的葡萄糖替换为 ¹³C 标记葡萄糖，研究人员可以追踪葡萄糖碳原子在糖酵解、磷酸戊糖途径、三羧酸循环、氨基酸合成、脂质合成和核苷酸合成等代谢网络中的流向。与传统代谢物含量检测相比，C13-Glucose 示踪实验不仅能回答“某个代谢物有多少”，更能进一步回答“它从哪里来、流向哪里、代谢通量是否发生改变”。稳定同位素示踪结合 LC-MS、GC-MS 或高分辨质谱检测，已成为解析细胞代谢重编程、肿瘤代谢、免疫代谢、线粒体功能和药物作用机制的重要技术手段。

一、C13-Glucose 的基本原理

C13-Glucose 是指葡萄糖分子中的部分或全部碳原子被稳定同位素 ¹³C 替代。最常见的是 D-Glucose-¹³C₆，也常写作 [U-¹³C₆]-Glucose，表示葡萄糖分子中的 6 个碳原子均被 ¹³C 标记。

当细胞或动物摄取 C13-Glucose 后，葡萄糖会进入正常的代谢网络。随着糖酵解、TCA 循环、磷酸戊糖途径和生物合成反应的进行，¹³C 会逐步转移到乳酸、丙酮酸、柠檬酸、琥珀酸、苹果酸、谷氨酸、天冬氨酸、核苷酸、脂肪酸等下游代谢物中。通过质谱检测这些代谢物的同位素峰型，可以获得不同代谢物的 M+0、M+1、M+2、M+3…… 同位素分布，从而判断葡萄糖碳源在不同通路中的利用情况。稳定同位素示踪技术正是通过定量这些标记模式和标记比例，揭示细胞或组织中的实际代谢活动。

二、C13-Glucose 适合研究哪些代谢通路

1. 糖酵解通路

C13-Glucose 最直接的应用是研究糖酵解活性。葡萄糖经过糖酵解后生成丙酮酸，进一步转化为乳酸或进入线粒体代谢。因此，检测 M+3 乳酸、M+3 丙酮酸、M+3 丙氨酸 等标记形式，可以反映葡萄糖进入糖酵解通路的程度。

在肿瘤细胞、免疫细胞活化、缺氧处理、药物干预或基因敲除实验中，C13-Glucose 常用于判断细胞是否发生糖酵解增强、乳酸生成增加或能量代谢重编程。

2. 三羧酸循环

葡萄糖经糖酵解生成丙酮酸后，可以进一步进入线粒体，转化为乙酰辅酶 A 并进入 TCA 循环。此时，柠檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、延胡索酸、苹果酸、谷氨酸和天冬氨酸等代谢物会出现不同程度的 ¹³C 标记。

例如，使用 [U-¹³C₆]-Glucose 后，如果检测到 柠檬酸 M+2、谷氨酸 M+2、苹果酸 M+2 等峰型，通常说明葡萄糖来源的乙酰辅酶 A 已进入 TCA 循环。若进一步出现 M+4 或更高标记形式，则提示 TCA 循环持续运转或发生多轮循环。¹³C 代谢流分析已经成为定量细胞内代谢通量的重要方法，尤其适用于研究肿瘤细胞代谢和中心碳代谢重编程。

3. 磷酸戊糖途径

葡萄糖还可以进入磷酸戊糖途径，生成核糖-5-磷酸和 NADPH。该通路与核苷酸合成、氧化还原稳态和脂质合成密切相关。

在 C13-Glucose 示踪实验中，可通过检测核糖部分、核苷酸前体或相关糖磷酸代谢物的标记情况，判断葡萄糖是否更多流向磷酸戊糖途径。对于肿瘤增殖、抗氧化应激、脂肪酸合成和药物耐受性研究，该方向具有较高应用价值。

4. 氨基酸代谢

C13-Glucose 不仅可以追踪碳源进入糖酵解和 TCA 循环，还可以进一步观察葡萄糖碳骨架向氨基酸的转移。例如：

因此，C13-Glucose 常用于分析细胞增殖、氨基酸合成、肿瘤代谢适应和营养限制条件下的代谢补偿机制。

5. 脂质和生物合成代谢

当葡萄糖碳源进入柠檬酸循环后，柠檬酸可输出到胞质中参与脂肪酸合成。因此，C13-Glucose 也可用于研究葡萄糖来源碳原子对脂肪酸、胆固醇、磷脂和糖基化前体的贡献。近年来，稳定同位素示踪代谢组学也被用于观察葡萄糖向核苷酸糖和细胞膜糖链合成的分配情况，说明该方法已经从传统中心碳代谢拓展到更复杂的糖基化和膜结构代谢研究。

三、常见 C13-Glucose 类型如何选择

1. D-Glucose-¹³C₆

这是最常用的葡萄糖示踪剂，适用于大多数糖酵解、TCA 循环、氨基酸合成、脂质合成和核苷酸合成研究。由于 6 个碳均被 ¹³C 标记，因此下游代谢物的同位素分布信息较丰富，适合做整体葡萄糖碳流向分析。

推荐应用：

• 肿瘤代谢重编程研究
• 糖酵解和乳酸生成分析
• TCA 循环碳流分析
• 线粒体功能研究
• 细胞增殖与核苷酸合成研究
• 药物处理前后代谢通路变化分析

2. D-Glucose-1-¹³C

D-Glucose-1-¹³C 只在葡萄糖 1 位碳上进行标记，更适合用于区分葡萄糖进入不同分支通路的情况，尤其可用于分析磷酸戊糖途径与糖酵解之间的碳流分配。

推荐应用：

• 磷酸戊糖途径研究
• NADPH 生成相关研究
• 氧化应激和还原力代谢分析

3. D-Glucose-2-¹³C 或其他位点标记葡萄糖

位点特异性标记葡萄糖适合更深入的代谢网络解析。与全标记葡萄糖相比，单点或双点标记葡萄糖能够提供更明确的碳原子去向信息，适用于较复杂的代谢模型和代谢通量计算。早期研究也表明，不同 ¹³C 葡萄糖示踪剂在代谢流分析中提供的信息量并不完全相同，合理选择示踪剂会影响通量解析能力。

四、C13-Glucose 代谢流实验的一般流程

1. 实验设计

在实验设计阶段，需要明确研究目的：是观察糖酵解增强，还是分析 TCA 循环通量，或者研究葡萄糖向核苷酸、脂质和氨基酸的流向。不同目的对应不同的示踪时间、样本类型和检测代谢物范围。

对于细胞实验，常见做法是在无葡萄糖培养基中加入一定浓度的 C13-Glucose，使其替代普通葡萄糖作为主要碳源。对于动物实验，可以通过灌胃、腹腔注射或静脉输注等方式给予 C13-Glucose，但动物实验设计需要综合考虑给药方式、时间窗口、组织采样速度和代谢周转速率。

2. 示踪时间设置

C13-Glucose 的示踪时间不能简单固定，应根据研究通路和样本类型确定。

对于代谢流分析而言，多时间点设计通常比单一终点更有价值，因为动态标记过程可以反映代谢物生成、转化和周转速度。

3. 样本淬灭与代谢物提取

由于中心碳代谢物周转速度快，样本采集后应尽快终止代谢反应。细胞样本通常需要快速去除培养基、低温洗涤并加入预冷提取溶剂；组织样本则应尽快冻存、研磨和提取。对于乳酸、丙酮酸、糖磷酸、有机酸等极性代谢物，常使用甲醇、水、乙腈等体系进行提取。对于脂质相关示踪实验，则需要采用适合脂质提取的溶剂体系。

4. LC-MS / GC-MS 检测

C13-Glucose 示踪实验常用 LC-MS、LC-MS/MS、GC-MS 或高分辨质谱平台检测下游代谢物的同位素分布。LC-MS 对极性代谢物、氨基酸、核苷酸和脂质检测较灵活；GC-MS 在有机酸、氨基酸衍生化检测和同位素模式解析方面也具有较强优势。稳定同位素标记结合 LC-MS 或 GC-MS，可以提高代谢物检测的灵敏度、特异性和代谢通路解析能力。

五、C13-Glucose 数据如何解读

C13-Glucose 示踪数据的核心不是单纯看某个代谢物总量，而是看该代谢物中 ¹³C 标记峰的比例和分布。

1. M+0、M+1、M+2……是什么意思

以乳酸为例，乳酸分子含有 3 个碳原子。如果使用 [U-¹³C₆]-Glucose 示踪：

• M+0 乳酸：没有 ¹³C 标记；
• M+1 乳酸：含有 1 个 ¹³C；
• M+2 乳酸：含有 2 个 ¹³C；
• M+3 乳酸：含有 3 个 ¹³C。

如果 M+3 乳酸比例明显升高，说明乳酸主要来源于 C13-Glucose 经糖酵解产生的丙酮酸。类似地，柠檬酸 M+2、苹果酸 M+2、谷氨酸 M+2 等可用于判断葡萄糖来源碳进入 TCA 循环的情况。

2. 同位素丰度需要校正

由于自然界中本身存在一定比例的 ¹³C、¹⁵N、²H 等同位素，质谱检测得到的 M+1、M+2 等峰并不完全来自实验加入的 C13-Glucose。因此，数据分析时通常需要进行自然丰度校正，避免高估真实标记比例。

3. 不能只看一个代谢物

代谢网络具有复杂性，同一个代谢物的标记变化可能受到多个通路共同影响。例如，谷氨酸标记既与 TCA 循环有关，也受谷氨酰胺代谢、转氨基作用和细胞氮代谢影响。因此，C13-Glucose 数据应结合多个代谢物共同判断，而不是只依据单一代谢物下结论。

六、C13-Glucose 实验中的常见问题

1. C13-Glucose 浓度是不是越高越好

不是。C13-Glucose 的浓度应尽量接近实验体系中正常葡萄糖浓度。如果浓度过高，可能人为改变细胞代谢状态；如果浓度过低，则可能造成营养限制或标记不足。对于细胞实验，应根据原培养基葡萄糖浓度、细胞类型和实验目的进行设置。

2. 是否需要完全替换普通葡萄糖

如果研究目的是追踪葡萄糖碳流，通常建议用 C13-Glucose 替代培养基中的普通葡萄糖，使葡萄糖成为明确的标记碳源。如果只是做短时间脉冲示踪，也可以根据实验设计采用部分替换或短时加入方式。

3. 为什么下游代谢物标记率很低

可能原因包括：

• 细胞对葡萄糖利用率较低；
• 示踪时间过短；
• 培养基中存在其他未标记碳源；
• 目标通路活性较弱；
• 样本淬灭不及时；
• 代谢物提取效率低；
• 检测方法灵敏度不足；
• 同位素数据未进行正确校正。

4. C13-Glucose 能不能直接说明通量大小

C13-Glucose 可以反映代谢碳流方向和相对变化，但严格的代谢通量定量通常还需要结合代谢网络模型、营养物消耗速率、产物生成速率和同位素分布数据。¹³C-MFA 的核心价值在于利用同位素标记模式和模型计算细胞内通量，而不是仅凭单个峰面积变化判断通量。

七、C13-Glucose 推荐应用方向

C13-Glucose 在以下研究方向中具有较高应用价值：

八、产品选择建议

针对常规代谢流分析实验，优先推荐使用：

D-Glucose-¹³C₆ / [U-¹³C₆]-Glucose

该产品适合大多数中心碳代谢示踪实验，尤其适用于糖酵解、乳酸生成、TCA 循环、氨基酸合成、脂质合成和核苷酸合成研究。

如果研究重点是磷酸戊糖途径或特定位点碳流解析，可进一步选择：

D-Glucose-1-¹³C
D-Glucose-2-¹³C
D-Glucose-1,2-¹³C₂
D-Glucose-6,6-d₂

其中，全标记葡萄糖适合整体碳流追踪，位点标记葡萄糖更适合精细区分代谢分支。

九、技术支持总结

C13-Glucose 是代谢流分析中最基础、最常用、也是信息量较高的稳定同位素示踪剂。通过 C13-Glucose 标记实验，研究人员可以从“静态代谢物含量检测”进一步进入“动态代谢流向解析”，从而更准确地理解细胞如何利用葡萄糖、葡萄糖碳源如何进入不同代谢通路，以及疾病、药物或基因调控如何改变细胞代谢网络。

在实际实验中，C13-Glucose 的应用效果取决于示踪剂选择、示踪时间、样本处理、质谱检测和数据校正等多个环节。对于糖酵解、TCA 循环、磷酸戊糖途径、氨基酸合成、脂质合成和核苷酸合成等研究方向，合理使用 C13-Glucose 能够显著提升代谢组学实验的解释深度和数据可信度。